利用三维离体视网膜成像技术研究阿尔茨海默病中内血-视网膜屏障的淀粉样蛋白β清除系统

《Alzheimers & Dementia》：Decoding amyloid beta clearance systems at inner blood–retina barrier using three-dimensional ex vivo retinal imaging in Alzheimer's disease

　　本研究通过三维视网膜成像和多种标记物分析，发现阿尔茨海默病（AD）患者的视网膜屏障（iBRB）存在Aβ清除功能障碍，表现为星形胶质细胞和Müller细胞退化、微胶质形态异常及可溶性Aβ多聚体（SAβOs）清除减少，揭示了iBRB在AD病理中的关键作用。

　　### 研究背景与意义

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征包括淀粉样蛋白β（Amyloid Beta, Aβ）的异常沉积和神经元功能障碍。Aβ是由淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein, APP）通过β-分泌酶和γ-分泌酶的连续切割产生的。在正常情况下，Aβ在大脑中以可溶性形式存在，其比例大约为90%的Aβ1-40和10%的Aβ1-42，而后者由于其高度神经毒性，在AD患者的脑组织中尤为显著。Aβ在AD的病程中表现出多种形式，包括单体、寡聚体和纤维状沉积物。这些形式中，可溶性Aβ寡聚体（Soluble Aβ Oligomers, SAβOs）被认为是导致突触功能障碍和神经退行性病变的主要病理因素。此外，近年来的研究表明，SAβOs的早期积累可能在AD病理过程的早期阶段就会影响记忆功能，并且减少这些寡聚体的水平可能有助于逆转认知障碍。这些发现突显了SAβOs在AD早期发病机制中的关键作用。

Aβ的清除机制在维持其稳态和防止其毒性聚集方面至关重要。大脑中Aβ的清除涉及多种生理过程，包括通过脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）的流动、血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的转运、血管周围循环和胶质-淋巴系统（Glymphatic System）。大约40%到60%的Aβ从大脑中扩散到血液中，并通过外周系统进行清除。Aβ在BBB中的转运依赖于多种转运蛋白，如低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1, LRP1）和晚期糖基化终产物受体（Receptor for Advanced Glycation End Products, RAGE），这些蛋白在血管内皮细胞和周细胞中表达。此外，固有免疫细胞，如巨噬细胞和小胶质细胞，在清除Aβ方面也发挥着重要作用，但它们的清除能力在AD中显著减弱。

在这一背景下，视网膜作为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的延伸部分，与大脑共享胚胎起源和血管系统，使用类似的分子、生长因子、神经递质和细胞结构。视网膜和大脑中，胶质细胞（如星形胶质细胞和小胶质细胞）与神经元之间存在相互支持的关系。近年来，研究者发现视网膜中的某些生物标志物可能与AD相关，例如视神经纤维层（Nerve Fiber Layer, NFL）的变薄，这一现象在AD患者中被光学相干断层扫描（Optical Coherence Tomography, OCT）所观察到，并且与疾病严重程度和认知衰退密切相关。此外，AD患者的视网膜中也发现了Aβ斑块，这提示了视网膜在AD诊断中的潜在应用价值。视网膜血管的变化，如血管密度降低、灌注减少和血管Aβ沉积增加，也表明了潜在的脑血管病理变化和Aβ清除障碍。

鉴于视网膜的复杂结构和其与大脑的紧密联系，研究者们开始探索视网膜中Aβ清除机制，特别是通过视网膜内血-视网膜屏障（Inner Blood-Retina Barrier, iBRB）进行的研究。iBRB作为BBB的功能性类比，其结构和功能与BBB相似，由非窗孔内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞/ Müller细胞的终足组成，这些结构富含水通道蛋白AQP4。由于iBRB的结构特性，它成为研究Aβ清除机制的理想部位。然而，传统的大脑组织研究由于结构复杂性，难以有效研究这些机制。因此，本研究采用视网膜整体（Wholemount）和三维（3D）体外成像技术，以探索iBRB在AD中的Aβ清除障碍，并揭示与大脑中清除机制相关的潜在关联。

### 研究方法与实验设计

本研究结合了人源和动物模型的实验设计，以全面评估视网膜和大脑中Aβ清除机制的差异。在人源样本方面，研究从加拿大温哥华的Vancouver General Hospital的病理科获取了10例AD患者和10例年龄匹配的对照者的眼组织样本。所有样本均经过尸检确认AD病理状态，符合国家老龄化与阿尔茨海默病协会（NIA-AA）的诊断标准。此外，还纳入了2例60岁以下的男性眼样本，以评估年龄相关的结构或形态变化。在动物模型方面，研究使用了APP/PS1双转基因小鼠（B6;C3-Tg, strain 034829-JAX），这些小鼠表达一种混合的鼠/人淀粉样前体蛋白（Mo/HuAPP695swe）和突变的人源早老素1（PS1-dE9），这些突变与早发性AD和淀粉样斑块形成相关。研究涉及两组年龄不同的小鼠：3-4个月龄（年轻）和9-10个月龄（年长），共16只雌性小鼠，分为四组（每组4只小鼠）。

在样本处理方面，研究人员首先进行了神经视网膜的分离，通过仔细解剖去除角膜、晶状体和虹膜，将眼杯分为四个主要象限（上、颞、下和鼻），以便尽可能多地排出液化的玻璃体液。每个象限进一步划分为三个扇形区域，并将神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜分离。在解剖过程中，使用镊子仔细去除任何残留的玻璃体组织。随后，从神经视网膜的颞侧和上侧象限的中周和外围区域取直径为3.5毫米的样本，确保不造成机械损伤或组织丢失。这些样本随后在磷酸盐缓冲液（1× PBS, pH 7.2–7.4）中清洗，并进行双或三色荧光染色。

在荧光标记方面，研究使用了多种抗体，包括针对Aβ1-42的12F4抗体、星形胶质细胞标志物GFAP和GS、水通道蛋白AQP4以及小胶质细胞/巨噬细胞标志物IBA1和CD68。为了区分血液来源的单核细胞/巨噬细胞与组织中的小胶质细胞/巨噬细胞，研究使用了CD45与IBA1和UEA-l（Ulex europaeus agglutinin）结合。此外，为了评估溶酶体活性，使用了LAMP1与IBA1和UEA-l的组合。由于验证样本量较小（每组1或2个样本），研究仅进行了定性评估。表S1总结了用于双色和三色免疫荧光染色的主要和次要抗体及其稀释比例。

在动物实验中，研究采用了标准化的双色免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术。研究人员使用了6E10抗体来检测APP和Aβ1-16的表达，并使用AQP4、GFAP、GS和IBA1等标志物来评估不同细胞类型的分布和功能。通过88%的甲酸预处理和标准抗原恢复方法，如使用0.05%的蛋白酶K在Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）中处理4分钟，或使用预热的柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行热诱导恢复。此外，为了验证6E10抗体对APP的特异性，研究人员使用了经过敲除验证的APP抗体，并在脑和眼的横截面中进行了免疫染色。SAβOs的检测则通过NIR（近红外）标记的E3纳米抗体进行，该抗体由免疫过载的骆驼驼峰免疫球蛋白（Nanobody）生成，并能通过BBB，显示出独特的空间分布。在人类视网膜整体样本中，SAβOs主要与神经元相关，而Aβ斑块则位于细胞外基质中。

在图像分析方面，研究人员使用了Zeiss LSM 800共聚焦显微镜和ZEN 3.7（Blue edition）软件。为了确保实验的一致性，研究对每种荧光标记物及其阴性对照进行了标准化的显微镜参数设置，包括激光波长、针孔、主增益和缩放。为了减少组织损伤和人工干扰，排除了图像中存在组织损伤、撕裂或其他异常的区域。研究使用了不同倍率的显微镜镜头（200×和100×）来获取不同层次的图像，并采用Z-stack图像（1微米切片）进行分析。在人类视网膜整体样本中，研究在视网膜神经节细胞层（Ganglion Cell Layer, GCL）和不同的视网膜层（如内核层、外核层和内/外丛状层）中获取了5个非重叠的视野。在小鼠脑横截面和视网膜横截面中，研究人员获取了4个非重叠的区域，用于分析不同的免疫标记物。

为了进行半定量分析，研究对Aβ斑块和小胶质细胞的数量进行了统计。此外，研究还对SAβO的纳米抗体信号进行了分析，以评估其在视网膜中的分布情况。所有统计分析和图像处理均使用ImageJ软件及其相关插件完成。研究人员使用了高分辨率的TIFF图像文件，用于小鼠脑样本（每种标记物8张图像/每只小鼠）和视网膜样本（每种标记物6张图像/每只小鼠），以及人类视网膜整体样本（每种标记物5个正交投影/每个供体）。免疫反应性由两名或更多独立研究者进行评估，且他们对样本身份不知情，以确保客观性。

在统计分析方面，研究人员对小鼠样本进行了差异基因表达分析，采用比较循环阈值（Ct）方法，通过Shapiro-Wilk检验评估数据的正态分布。由于样本池化，每个目标基因的Ct值均呈正态分布，因此使用双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Bonferroni校正，以分析不同组之间的差异。差异基因被定义为在组间差异≥2倍且统计学显著（p < 0.05）的基因。对于小鼠样本的蛋白表达分析，研究使用了ROUT方法（Q = 1%）来排除异常值，并通过Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。根据数据分布情况，研究使用了Brown-Forsythe和Welch ANOVA或Kruskal-Wallis检验结合Dunn的多重比较检验。在人类视网膜整体样本中，研究使用了无配对t检验（Student's或Welch's校正t检验）或Mann-Whitney U检验，以比较AD和对照组之间的差异。

### 研究结果与发现

#### 人类视网膜整体样本的Aβ表达模式

在人类视网膜整体样本中，研究人员观察到了Aβ表达模式的显著变化。在AD神经视网膜中，Aβ42主要以团块状沉积的形式存在，而在对照样本中，Aβ42则沿着类似排水路径的结构分布。此外，AD样本中的AQP4水通道在视网膜神经节细胞层（GCL）和内/外核层（INL和ONL）的表达明显减少，而对照样本中的AQP4水通道在这些区域保持相对完整。研究还发现，AD样本中的Aβ沉积在血管周围更为明显，而在对照样本中，Aβ沿着血管周围的排水路径分布，显示出较强的清除能力。这些结果表明，AD患者的视网膜中，Aβ的清除机制受到显著影响，导致其在血管周围形成团块状沉积。

#### SAβO的清除障碍

研究进一步探讨了SAβO的清除情况。通过使用NIR标记的E3纳米抗体，研究人员发现SAβO在对照样本中主要分布在视网膜血管中，而AD样本中SAβO的清除显著减少。此外，研究发现，在AD样本中，SAβO主要集中在视网膜神经节细胞层（GCL）和更深层的结构中，而对照样本中SAβO的分布更为均匀。这一发现表明，AD患者的视网膜中，SAβO的清除机制受到严重破坏，可能与Aβ的聚集和毒性有关。

#### 小胶质细胞的形态变化

在AD神经视网膜中，小胶质细胞（IBA1+）的形态发生了显著变化。与对照样本中圆润的小胶质细胞不同，AD样本中的小胶质细胞表现出杆状或延长的形态，且其吞噬功能受损。此外，AD样本中部分小胶质细胞表现出CD68+的共定位，这可能与吞噬活动相关，但在对照样本中，小胶质细胞与CD68的共定位更为普遍。这一发现表明，AD患者的视网膜中，小胶质细胞的吞噬功能受到损害，可能导致Aβ的积累和毒性增强。

#### 宏观胶质细胞的退化

研究还发现，AD样本中的宏观胶质细胞（GFAP+和GS+）表现出明显的退化。GFAP+星形胶质细胞在AD样本中表达显著减少，而GS+ Müller细胞的表达也出现下降。此外，AD样本中宏观胶质细胞的附着能力下降，导致其与血管壁的连接减弱。这些变化可能与视网膜中AQP4的表达减少有关，而AQP4是水通道蛋白，参与了Aβ的清除过程。研究发现，AD样本中的AQP4表达显著低于对照样本，这可能与视网膜中Aβ的清除障碍有关。

#### AQP4水通道的分布与功能变化

AQP4水通道蛋白在视网膜和大脑中的分布具有显著差异。在AD样本中，AQP4的表达不仅在终足处减少，而且在非终足区域的分布也受到破坏。这种变化可能导致Aβ的清除能力下降，从而加剧AD的病理进程。在对照样本中，AQP4的表达保持完整，主要集中在视网膜神经节细胞层（GCL）和内/外核层（INL和ONL）的终足和非终足区域。相比之下，AD样本中的AQP4表达显著降低，这可能与Aβ的积累和毒性有关。

### 讨论与意义

本研究通过体外三维视网膜成像，首次揭示了AD中iBRB的Aβ清除障碍，为AD的病理机制提供了新的视角。iBRB作为BBB的功能性类比，其结构和功能与BBB相似，但研究者发现，由于iBRB的特殊结构，传统的体外脑组织研究难以有效评估其清除机制。相比之下，视网膜整体成像能够提供更详细的可视化，揭示Aβ在视网膜中的分布和清除过程。

在AD样本中，Aβ的清除能力显著下降，导致其在血管周围形成团块状沉积。这与AD患者脑组织中Aβ的聚集现象类似，表明视网膜和大脑在Aβ清除机制上的相似性。然而，视网膜中Aβ的清除可能涉及不同的细胞类型，如外周的巨噬细胞样细胞和视网膜中的小胶质细胞。研究发现，AD样本中这些细胞的吞噬能力下降，导致Aβ的清除受阻。

此外，研究还发现，视网膜的解剖平面（表面与横截面）可能影响AD病理特征的观察结果。在表面成像中，Aβ的分布可能更接近其清除路径，而在横截面成像中，Aβ的聚集可能更为明显。这一发现强调了研究中选择合适的成像平面的重要性，以准确评估AD的病理特征。

在动物模型中，研究发现APP-PS1小鼠的视网膜中，Aβ的表达和胶质细胞的激活均随年龄增长而增加。这表明，随着年龄增长，视网膜中的Aβ清除能力下降，导致其在血管周围聚集。此外，研究还发现，小胶质细胞和星形胶质细胞在AD小鼠视网膜中的表达显著增加，这可能反映了神经炎症反应和胶质细胞的激活。

本研究的结果不仅揭示了AD视网膜中的Aβ清除障碍，还为AD的早期诊断和治疗提供了新的思路。通过体外三维成像技术，研究者能够观察到Aβ在视网膜中的分布和清除过程，为AD的病理机制提供了更直观的证据。此外，研究还强调了视网膜作为AD研究模型的潜在价值，为未来的研究提供了新的方向。

### 研究局限与未来方向

尽管本研究取得了重要的发现，但也存在一定的局限性。首先，研究主要依赖于体外成像，因此无法评估Aβ清除或排水过程的功能性变化。其次，研究样本量较小，尤其是AD患者的样本数量有限，这可能影响结果的统计效力。此外，研究未能区分视网膜中的静脉和动脉，这可能限制了对Aβ清除路径的进一步分析。最后，由于样本量有限，研究未能全面分析AD患者的共病情况，这可能影响对AD病理机制的全面理解。

未来的研究应考虑扩大样本量，以提高统计的可靠性和代表性。此外，研究应包括不同性别和年龄的样本，以评估性别和年龄对Aβ清除机制的影响。同时，研究应探索其他可能的Aβ清除机制，如淋巴系统和血管周围通道的相互作用。此外，研究还应考虑使用不同的成像技术，如动态成像和多模态成像，以更全面地评估Aβ的清除过程。

### 结论与展望

本研究通过体外三维视网膜成像，首次揭示了AD中iBRB的Aβ清除障碍，为AD的病理机制提供了新的证据。研究发现，AD样本中Aβ的清除能力显著下降，导致其在血管周围形成团块状沉积。此外，研究还发现，外周的巨噬细胞样细胞在AD样本中的Aβ清除能力受损，这可能与AD的神经炎症反应有关。这些发现不仅加深了对AD病理机制的理解，也为AD的早期诊断和治疗提供了新的思路。未来的研究应进一步探索视网膜作为AD研究模型的潜力，并结合多种成像技术和分子生物学方法，以更全面地评估Aβ清除机制。