P4HA2通过调控PINK1/parkin介导的线粒体自噬增强食管癌125I粒子内照射抵抗的机制及靶向治疗策略

　　本研究针对食管癌125I粒子内照射后放射抵抗的临床难题，发现内质网相关蛋白P4HA2通过结合ATAD3A调控PINK1/parkin依赖性线粒体自噬，介导放射抵抗。临床分析显示P4HA2高表达与不良预后相关，其表达受IGF2BP2 m6A甲基化修饰调控。研究开发了叶酸靶向纳米载药系统沉默P4HA2，显著增强125I内照射疗效，为克服食管癌放射抵抗提供了新靶点和联合治疗策略。

　　

食管癌作为全球第六大癌症相关死亡原因，尤其在亚洲地区高发，其中食管鳞状细胞癌(ESCC)是最主要的病理类型。由于早期诊断困难且侵袭性强，食管癌患者总体预后较差，晚期患者5年生存率不足25%。介入内照射治疗如碘125(125I)粒子植入联合支架置入术，为晚期梗阻性食管癌患者带来了革命性的治疗突破，显著改善了患者预后和生活质量。然而，大多数接受125I内照射治疗的患者最终会出现放射抵抗现象，这成为制约治疗效果的关键瓶颈。

以往研究发现，内照射治疗可通过诱导活性氧(ROS)介导的细胞凋亡和自噬来杀伤肿瘤细胞，同时引起显著的内质网应激。抑制内质网应激介导的自噬能够增强125I内照射的抗癌效果。线粒体自噬(mitophagy)作为选择性清除受损线粒体的过程，帮助癌细胞在放疗后维持代谢平衡并减少ROS产生，从而促进癌细胞存活。然而，线粒体自噬在125I内照射中的作用尚未明确。

近期研究表明，脯氨酰-4-羟化酶亚基2(P4HA2)在肿瘤学中扮演关键角色，与不良预后相关。P4HA2能够稳定HIF-1α蛋白，降低膀胱癌中ROS水平，并促进肿瘤增殖、侵袭和迁移。但其在连续低剂量内照射治疗中的作用尚未见报道。

本研究通过蛋白质组学分析发现，在125I内照射处理后，ESCC细胞中P4HA2表达显著上调。临床分析显示，P4HA2在ESCC组织中高表达，且与患者较短的总生存期和无进展生存期相关。根据既往研究将177天作为生存分界点，发现125I内照射抵抗患者肿瘤组织中P4HA2表达显著高于敏感患者。

机制研究表明，P4HA2通过与线粒体蛋白ATAD3A相互作用，调控PINK1/parkin依赖性线粒体自噬通路。P4HA2敲低能够抑制ESCC细胞迁移和侵袭能力，减少体内转移；而过表达则促进细胞迁移和侵袭。在125I内照射条件下，P4HA2敲低显著增强DNA损伤(γ-H2AX焦点形成)、细胞凋亡和放射敏感性，而过表达则产生相反效果。

研究人员进一步发现，P4HA2的表达受m6A甲基化修饰调控。IGF2BP2以m6A依赖性方式识别并结合P4HA2的3'UTR区域，稳定P4HA2 mRNA并增加其表达。METTL3/METTL14敲低或IGF2BP2敲低均降低P4HA2表达。

为探索靶向P4HA2的治疗潜力，研究团队开发了叶酸靶向的阳离子脂质纳米载药系统(siLipo-FA)用于递送P4HA2 siRNA。体内外实验表明，siLipo-FA能有效靶向肿瘤组织，沉默P4HA2表达，显著增强125I内照射的抗肿瘤效果，抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。系统性毒性评估显示该纳米系统具有良好的生物安全性。

主要技术方法包括：蛋白质组学(TMT标记)筛选差异表达蛋白；免疫共沉淀结合质谱分析(Co-IP/MS)鉴定蛋白相互作用；体内外125I内照射模型(细胞4Gy累积剂量，小鼠33.09Gy累积剂量)；m6A甲基化分析(RIP-qPCR、RNA稳定性测定)；纳米载药系统制备与表征(粒径152nm，zeta电位7.68mV)；临床样本分析(185例ESCC组织芯片，24例内照射前活检样本)。

研究结果：

P4HA2在ESCC患者中上调且与125I内照射不良预后相关

蛋白质组学分析发现125I内照射后67个差异表达蛋白，其中P4HA2表达显著上调。临床组织芯片分析显示P4HA2在肿瘤组织中高表达，且与患者较短生存期相关。125I内照射抵抗患者肿瘤组织中P4HA2表达高于敏感患者。

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P4HA2促进ESCC体外和体内转移

P4HA2敲低抑制ESCC细胞迁移和侵袭能力，而过表达则促进这些恶性表型。体内实验表明P4HA2敲低减少肺转移灶形成。

P4HA2抑制ESCC对125I内照射的敏感性

P4HA2敲低增强125I内照射诱导的DNA损伤(γ-H2AX焦点增加)和细胞凋亡，而过表达则减少这些效应。P4HA2敲低逆转内照射诱导的自噬相关蛋白(LC3II、SQSTM1/P62、Beclin-1)表达变化。

P4HA2与ATAD3A在线粒体和内质网中相互作用

免疫共沉淀结合质谱分析发现P4HA2与ATAD3A存在相互作用，这一作用在照射后增强。结构域映射显示相互作用需要ATAD3A的ATPase结构域(258-586氨基酸)和P4HA2的P4Hc结构域(336-535氨基酸)。

P4HA2和ATAD3A通过PINK1/parkin通路调控线粒体自噬

电镜观察显示P4HA2敲低抑制内照射诱导的线粒体自噬体形成。P4HA2敲低降低PINK1、parkin和LC3II蛋白表达，即使在CCCP(线粒体自噬激动剂)处理后也是如此。ATAD3A敲低产生类似效果，增强放射敏感性。

IGF2BP2以m6A依赖性方式增加P4HA2表达

m6A-RIP实验证实P4HA2的3'UTR存在m6A修饰。IGF2BP2识别这一修饰并稳定P4HA2 mRNA。突变m6A结合位点或使用IGF2BP2突变体(KH结构域突变)消除这一调控作用。

叶酸靶向阳离子脂质体携带siRNA改善内照射治疗效果

制备的siLipo-FA纳米颗粒粒径152nm，在N/P=20时完全包裹siRNA。叶酸修饰增强肿瘤细胞摄取和体内靶向性。siLipo-FA显著增强125I内照射的抗肿瘤效果，抑制肿瘤生长并诱导凋亡。系统性毒性评估显示良好安全性。

研究结论与讨论：

本研究揭示了P4HA2作为125I内照射抵抗的关键调控因子，通过直接结合ATAD3A蛋白，调控PINK1/parkin依赖性线粒体自噬，促进食管癌放射抵抗。临床分析证实P4HA2高表达与患者不良预后相关。表观遗传学研究表明，IGF2BP2通过m6A甲基化修饰稳定P4HA2 mRNA，增加其表达。

研究的创新点在于首次发现P4HA2-ATAD3A复合物在调控线粒体自噬中的重要作用，揭示了内质网蛋白与线粒体蛋白之间的功能联系；阐明了m6A甲基化修饰在调控P4HA2表达中的机制；开发了叶酸靶向纳米载药系统，为临床转化提供了潜在治疗策略。

这些发现不仅为理解食管癌125I内照射抵抗机制提供了新视角，也为开发联合治疗策略奠定了理论基础。靶向P4HA2可能成为克服食管癌放射抵抗的有效手段，特别是与125I内照射联合应用时。未来研究可进一步探索P4HA2-ATAD3A相互作用的详细结构基础及其在其他癌症类型中的普适性。

该研究发表于《Cell Death and Disease》，为食管癌精准治疗提供了新的分子靶点和治疗策略，具有重要的临床转化价值。