靶向线粒体翻译与OXPHOS消除高级别浆液性卵巢癌干细胞样细胞的新策略

　　本研究针对高级别浆液性卵巢癌(HGSC)异质性及肿瘤干细胞(CSCs)介导的耐药难题，通过血清饥饿(SS)模拟肿瘤微环境，发现不同表型细胞均通过线粒体翻译和氧化磷酸化(OXPHOS)途径获得干性特征。研究证实抑制线粒体功能可有效消除干细胞样细胞，为靶向HGSC再生潜能提供了新治疗策略。

　　

高级别浆液性卵巢癌(HGSC)是妇科恶性肿瘤中最具侵袭性的类型，其早期检测和治疗面临巨大挑战。这种挑战主要源于肿瘤间和肿瘤内存在的复杂生物学异质性。更棘手的是，肿瘤中的癌症干细胞(CSCs)通过其静息状态(细胞周期停滞)、药物外排泵的存在以及支持自我更新的信号通路(如Hedgehog、Notch和Wnt信号通路)，在转移、耐药和疾病复发中扮演关键角色。然而，体外研究CSCs通常需要在含有血清的培养基中进行，而血清提供的多种生长因子和有丝分裂原可能会破坏CSCs的静息状态，使其快速增殖而非维持严格的自我更新程序，这使得研究结果难以反映体内的真实情况。

为了克服这一局限，研究人员采用血清饥饿(Serum Starvation, SS)的方法，模拟营养匮乏的肿瘤微环境，诱导细胞进入静息或慢周期状态。本研究旨在阐明一组涵盖上皮(E)、中间上皮(iE)、上皮-间质杂交(E/M)、中间间质(iM)和间质(M)表型梯度的高级别浆液性卵巢癌(HGSC)细胞系在无血清培养基中生长时，其干细胞样细胞的蛋白质组学特征，并探索其潜在的代谢重编程机制和治疗靶点。

研究人员运用了多种关键技术方法开展本研究。他们首先通过细胞周期分析、PKH26标记示踪技术以及干细胞标志物（如Nanog、Oct4）表达检测，证实了血清饥饿有效富集了慢循环/静息的干细胞样细胞。随后，采用基于MaxQuant的无标记定量蛋白质组学技术(LFQ)对血清饥饿(SS)与血清培养(+S)的细胞进行了差异蛋白质组学分析。在代谢功能验证层面，研究综合运用了葡萄糖消耗/乳酸生成测定、线粒体质量/膜电位/活性氧(ROS)检测、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数分析、脂滴染色以及靶向代谢组学(LC-HRMS)分析TCA循环代谢物。在机制探究上，通过透射电子显微镜(TEM)详细观察了线粒体超微结构（包括嵴形态、嵴连接宽度等），并利用数学建模模拟了线粒体动力学与细胞能量学。最后，通过体外3D肿瘤球形成实验和体内小鼠异种移植模型，评估了靶向线粒体翻译（使用抗生素如多西环素、红霉素）和OXPHOS（使用抑制剂如抗霉素A、寡霉素、Metformin）的治疗策略效果。

血清饥饿调控‘干性’特征富集和表型特异性蛋白质组谱

研究人员比较了HGSC细胞系在血清饥饿(SS)与血清培养(+S)条件下的细胞周期分布，发现SS条件下所有表型细胞的G0/G1期细胞比例均显著增加，S期细胞比例减少。通过PKH26标记示踪实验，证实SS条件下所有表型均保留了大量的PKH^hi（静息/慢循环）和PKH^lo（有限分裂）细胞群体，而在+S条件下这些群体迅速耗竭。同时，SS条件下所有表型细胞的自我更新标志物Nanog表达显著增强（E/M表型除外），Oct4在上皮表型中富集。这些结果表明，血清饥饿可作为研究HGSC跨分子表型干细胞样状态的有效替代模型。

蛋白质组学分析进一步揭示了SS条件下，不同表型细胞中差异富集（独有或显著上调>2倍）的蛋白质各不相同，相邻表型间仅共享少数候选蛋白，没有蛋白质在所有表型的SS条件下均被共同富集。这表明，尽管在血清剥夺条件下获得了共同的干细胞样状态，但每种表型都伴随着特异且多样的蛋白质表达，这与细胞表型特异的分子网络和对微环境信号的反应相一致。

线粒体代谢通路在血清剥夺条件下普遍富集

对SS条件下各表型富集蛋白质的通路分析显示，E、iE和E/M表型关联的生物学功能和通路差异明显，而M和iM表型则共享许多共同通路。最有趣且出乎意料的是，所有表型中共同富集的最显著通路是线粒体翻译（起始、延伸、终止），并与三羧酸循环(TCA cycle)、电子传递链(ETC)、氧化还原酶复合物、线粒体核糖体、线粒体膜、线粒体基因表达、线粒体基质等GO术语显著相关。

这种关联是独特的，尽管大多数线粒体相关蛋白质对每种表型都是独特的，且相邻表型间蛋白质的共同性有限。同时，CSC相关分子通路（上皮表型中富集MAPK信号和RAS突变，间质表型中富集Hedgehog信号和ABC家族蛋白介导的转运）的并发富集，证实了SS通过相似的反应在不同表型中重现了干性特征。这些数据表明，血清剥夺后线粒体代谢通路的激活可能与应激反应相关，并伴随着干细胞样状态的获得。

血清饥饿触发从糖酵解到OXPHOS的代谢转换

与快速分裂的癌细胞偏好糖酵解不同，研究发现SS导致所有表型细胞的葡萄糖摄取和乳酸产生减少，表明其偏好转向氧化磷酸化(OXPHOS)。使用糖酵解抑制剂（2-DG、DCA）或OXPHOS抑制剂（鱼藤酮、抗霉素A、寡霉素）进行处理后发现，只有在血清剥夺条件下，OXPHOS抑制才能显著损害各种表型亚型的细胞活力。

流式细胞术进一步证实，血清剥夺后所有表型细胞的线粒体生物量均增加。同时，与核DNA相比，mtDNA拷贝数增加，线粒体膜电位（TMRM测定）表明SS条件下线粒体被激活，活性氧(ROS)水平也随之增加，但由于细胞已进入静息状态，这可能并不具有细胞毒性。这些数据表明，静息的CSCs拥有更活跃的线粒体，并依赖OXPHOS作为其主要能量来源，这使得它们能够在营养胁迫条件下生存。

血清饥饿下的HGSC细胞依赖储存的脂肪酸供能

为了探究细胞在血清饥饿下是否依赖储存的脂肪酸(FAO)供能，研究人员分析了SS 48小时后细胞中脂滴(LD)的频率。与对照(+S)相比，饥饿后所有表型细胞的LD均显著减少，表明在营养剥夺下储存的脂肪酸被动员用于能量生成。通过使用肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)抑制剂Etomoxir分析细胞存活情况，进一步证实了这种对FAO的依赖性（除OVCA420 (E/M表型)外，所有SS条件下的细胞系对抑制剂都更敏感）。由于通路分析也表明所有表型中“TCA循环和呼吸电子传递”显著富集，代谢组学分析证实SS 48小时后，TCA代谢物（顺乌头酸、异柠檬酸、琥珀酸、富马酸和草酰乙酸）的产量相较于+S对照有所增加。结论是，血清剥夺下的HGSC细胞依赖FAO和储存的脂肪酸来为TCA循环、ETC以及随后的OXPHOS提供能量需求。

血清饥饿下的HGSC细胞线粒体发生融合并呈现更薄的嵴和紧密的嵴连接

与“形式追随功能”的原则一致，研究人员发现响应血清剥夺，HGSC细胞的线粒体形态从球状转变为更细长的形态。二维透射电子显微镜(2D-TEM)成像和分析进一步提示HGSC SS细胞中存在潜在的线粒体融合事件（Feret直径、长宽比(AR)、周长和长度均显著增加）。这得到了线粒体动力学调节因子蛋白表达水平的支持：在血清剥夺条件下，HGSC表型中OPA1（融合蛋白）的表达总体呈上升趋势，而DRP1（分裂蛋白）水平下降。

对线粒体嵴结构的分析发现，嵴宽度与单位线粒体长度上的嵴数量呈负相关。在+S条件下，(E)状态与较少且较宽的嵴相关，并向(M)状态逐渐增加。而在SS条件下，这一趋势发生逆转，与对照组相比，所有表型的嵴连接(CJs)宽度显著减小，单位线粒体长度上的嵴数量增加。这些观察结果强有力地证明，HGSC细胞通过代谢转换至OXPHOS并重塑其线粒体超微结构特征来适应血清剥夺，以优化能量需求。

数学建模支持线粒体动力学结果并预测融合线粒体具有更高的ATP转换率

通过数学建模模拟表型依赖的线粒体动力学和能量输出，该模型预测在血清应激下，健康融合(HF)线粒体的数量会增加，而健康单位(HU)和偏差单位(DU)线粒体随时间推移几乎完全从系统中耗尽。这通过TEM分析得到了实验证实，SS条件下细长HF线粒体的频率高于无应激的+S环境（后者显示更高的HU线粒体频率）。模型还预测，在+S条件下，HF线粒体分布从“M”表型(OVMZ6)最高到“E”表型(OVCAR3)最低；而在SS条件下，这一情况完全逆转。最重要的是，该模型预测所有HGSC表型在SS后的ATP产量均显著增加，其中E和E/M表型(OVCAR3和OVCA420)的ATP产量最大，而iE(A4)的能量可能最低。这些关于细胞能量学的预测通过ATP测定实验得到了证实，E、E/M和iE表型在SS后确实表现出 elevated 的ATP生产水平。

抑制OXPHOS和线粒体翻译损害体外自我更新和体内肿瘤进展

通过体外悬浮肿瘤球形成实验验证了SS后干细胞样细胞的生成及其对OXPHOS和线粒体功能的依赖性。使用OXPHOS(ETC)抑制剂和抗生素（利用细菌与线粒体核糖体的相似性抑制线粒体翻译）进行单独或联合药物处理，均观察到球体形成能力显著降低。多西环素和红霉素的抑制作用最为显著。为了评估线粒体活性与CSC自我更新之间的关联是否可在原位被利用，研究人员在荷瘤小鼠中使用多西环素和红霉素（单独或与紫杉醇联用）进行处理。结果表明，接受抗生素方案（单独或与紫杉醇联合）的小鼠，其A4异种移植瘤的生长和进展显著减少。将ETC复合物I抑制剂二甲双胍纳入给药方案的研究发现，共同靶向OXPHOS和线粒体翻译与靶向非CSC分裂细胞的常规化疗（紫杉醇）联合，可以显著抑制HGSC肿瘤的进展。其中，二甲双胍、红霉素和紫杉醇(Metformin+Ery+Pax)联合方案在治疗结束时（第21天）表现出最显著的肿瘤抑制效果。

结论与讨论

本研究揭示了HGSC细胞在血清饥饿应激下，尽管存在显著的表型异质性和独特的蛋白质组谱，却共同转向依赖线粒体翻译、脂肪酸氧化(FAO)、TCA循环和氧化磷酸化(OXPHOS)的代谢模式，并伴随干细胞样特征的获得。这种代谢重编程在超微结构上体现为线粒体融合、嵴数量增加、嵴变薄以及嵴连接变紧，这些变化共同优化了OXPHOS效率。研究人员开发的数学模型成功整合了超结构细节和蛋白表达数据，预测了不同表型下的细胞能量学差异。更重要的是，研究证实靶向线粒体翻译（使用抗生素）和OXPHOS（使用二甲双胍等抑制剂）能够有效破坏CSC的自我更新能力，并在体内显著抑制肿瘤进展，尤其是与常规化疗药物联合时效果更佳。

该研究的深刻意义在于它揭示了靶向线粒体功能作为一种克服HGSC异质性和消除肿瘤再生潜能的新治疗策略的巨大潜力。尽管不同HGSC细胞表型在分子网络上存在差异，但它们却共享一条共同的脆弱性代谢通路——线粒体OXPHOS依赖。这为开发针对顽固性CSC群体的新型疗法，例如重新利用抗生素（如多西环素、红霉素）和降糖药（如二甲双胍），并将其与现有化疗方案联合，以提高治疗效果和防止疾病复发提供了强有力的理论依据和实验证据。未来，针对线粒体嵴形态发生、线粒体-内质网接触(MERC)等过程的更深入研究，有望进一步拓展靶向肿瘤代谢的治疗视野。