靶向MEK5/ERK5通路克服NRAS突变黑色素瘤MAPK靶向治疗耐药的新机制：Cyclin D/CDK4介导的G1/S期阻滞关键作用

　　本研究针对NRAS突变黑色素瘤对MAPK靶向治疗（MAPKi）易产生耐药的关键临床问题，通过联合MEK5/ERK5抑制策略，发现该联合治疗通过抑制Cyclin D1/CDK4活性诱导持续性G1期阻滞，进而导致有丝分裂基因表达全面关闭。该机制在初治和MEKi耐药细胞中均有效，为NRAS突变黑色素瘤提供了新的治疗思路。

　　

在皮肤黑色素瘤治疗领域，尽管免疫疗法和靶向治疗取得了显著进展，但NRAS突变型黑色素瘤患者仍然面临严峻挑战。与BRAF突变患者相比，这类患者预后显著较差，其主要原因在于NRAS突变肿瘤对RAS/RAF/MEK/ERK丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路靶向治疗（MAPKi）表现出高度的固有和获得性耐药。这种耐药性成为临床治疗的主要瓶颈，迫切需要探索新的治疗策略。

近年来，应激激活的MEK5/ERK5 MAPK信号级联被发现在多种MAPK激活的癌症中作为逃逸通路，使肿瘤细胞能够在MAPKi治疗下存活和增殖。特别是在RAS驱动肿瘤中，MAPKi与ERK5抑制剂（ERK5i）联合使用显著改善了治疗效果，部分通过防止治疗耐药性和转向ERK5介导的增殖。先前研究表明，MEK抑制剂（MEKi）会导致ERK5激活，而同时抑制MEK和ERK5能够在BRAF和NRAS突变黑色素瘤中诱导凋亡和 prolonged 细胞周期阻滞。然而，这种联合治疗的作用模式和分子效应器仍不清楚。

发表在《Cell Death and Disease》的这项研究通过综合运用转录组分析、遗传学方法和药理学抑制剂，深入探究了MAPKi/ERK5i诱导NRAS突变黑色素瘤细胞周期阻滞的机制。研究人员发现，这种联合治疗能够引起近乎完整的有丝分裂机器关闭，这是持续性G1细胞周期阻滞的结果。

研究采用的主要技术方法包括：RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化；流式细胞术进行细胞周期分析；蛋白质免疫印迹检测关键细胞周期调控因子表达；CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MEK5基因敲除细胞系；稳定过表达Cyclin D1/CDK4的细胞系构建；BrdU标记实验评估DNA合成活性；细胞倍增时间分析评估增殖能力。

RNA-seq揭示MEK5在MEKi下的增殖作用

为了揭示ERK5i相对于单独MEKi的额外益处，研究人员对NRASQ61L驱动的FM79黑色素瘤细胞进行了RNA-seq分析。功能注释聚类分析发现，"核分裂"包含96个细胞周期相关基因，是siMEK5下调基因中第二最富集的功能术语。此外，还发现几个有丝分裂相关簇的富集，表明MEK5缺失影响有丝分裂基因表达。特别值得注意的是，G2M进程的主调控因子FOXM1及其转录靶标如CCNB1、PLK1和AURKB出现在siMEK5抑制的基因中。

MEKi/ERK5i依赖性有丝分裂基因抑制是G1阻滞的次级效应

通过DNA谱动力学分析，研究人员发现联合治疗没有损害G2M进程，但在16小时后观察到快速的G1期阻滞。这种阻滞与关键G1/S调控因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平降低相关，而FOXM1减少则较延迟，表明有丝分裂基因抑制是G1/S抑制的次级事件。

MEKi耐药黑色素瘤细胞仍对联合MEKi/ERK5i敏感

研究人员发现，MEKi耐药（Tram^R）细胞在联合MEKi/ERK5i治疗后24小时内重新获得G1期阻滞，表现为S期细胞比例显著减少，同时伴随RB Ser780位点（Cyclin D/CDK4特异性位点）磷酸化丢失，以及Cyclin D1、cMyc和E2F靶标Cyclin E2和EMI1表达减少。

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R黑色素瘤细胞的G1阻滞'>

MEK5是MEKi下G1/S进程所必需的

通过CRISPR/Cas9介导的基因 disruption，研究人员发现MEK5缺陷能够重现药理学ERK5i的结果。MEK5敲除单细胞克隆在Tram治疗下表现出 robust 的G1阻滞，表明MEK5对于NRAS突变黑色素瘤细胞的正常增殖是可有可无的，但在MEKi下的G1/S进程中是关键的。

Cyclin D1/CDK4过表达本身不足以完全克服MEKi/ERK5i联合治疗诱导的G1阻滞

研究人员通过 rescue 实验发现，在短期实验中，Cyclin D1/CDK4过表达仅能部分逆转ERK5i诱导的G1阻滞。即使结合p21或p27 knockdown，也只能在Cyclin D1/CDK4过表达的情况下有效逆转ERK5i联合治疗的额外抗增殖效应。

R细胞的抗增殖效应'>

Cyclin D1/CDK4重新表达足以恢复长期MEKi/ERK5i阻滞细胞的G1/S进程

在长期治疗设置中，外源性Cyclin D1/CDK4表达显著改善了Tram/ERK5i联合治疗细胞的细胞周期进程，表现为DNA谱分析中的S期进程恢复，RB-S780磷酸化重建和FOXM1重新表达。

研究结论与讨论部分强调，ERK5i能够显著增强MEKi在NRAS突变黑色素瘤中的疗效。诱导的G1阻滞是多因素的和 robust 的，可能降低了耐药性发展的可能性。而且这种效应显然与黑色素瘤分化状态无关。研究进一步强调了MEKi/ERK5i治疗时机的重要性，缩小了发展耐药性的窗口。鉴于这种 robust 和持久的细胞周期阻滞，研究人员提出特别是那些不符合免疫检查点阻断治疗条件或对其耐药的NRAS突变黑色素瘤患者可能从MEKi/ERK5i联合治疗中获益。

值得注意的是，这种联合治疗诱导的G1阻滞主要依赖于Cyclin D1/CDK4活性的抑制，这很可能是由于Cyclin D1抑制，尽管增加的p21/p27诱导可能额外抑制CDK4活性。此外，观察到的FOXM1蛋白逐渐丢失可能通过破坏E2F靶标（包括Cyclin E2）的积累进一步加强G1阻滞。

这些发现不仅为NRAS突变黑色素瘤的治疗提供了新的策略，也为了解MAPK信号网络的复杂性和细胞周期调控的分子机制提供了重要见解。该研究强调了靶向多个信号通路节点在克服肿瘤耐药性方面的重要性，为未来临床治疗方案的优化提供了理论基础。