HUWE1缺失通过破坏β-catenin降解复合体促进结直肠癌干细胞特性与化疗耐药性的机制研究

　　本研究针对结直肠癌（CRC）中Wnt/β-catenin信号异常激活导致的肿瘤干细胞（CSCs）特性及化疗耐药性问题，揭示了E3泛素连接酶HUWE1在调控β-catenin稳定性中的关键作用。研究人员通过基因敲降、功能实验及临床数据分析，发现HUWE1缺失通过稳定β-catenin、诱导线粒体生物合成和增强ABC转运蛋白活性，显著促进CRC的干细胞特性、上皮-间质转化（EMT）及耐药性。该研究为靶向HUWE1-Wnt/β-catenin轴克服CRC耐药提供了新策略。

　　

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，其高异质性和化疗耐药性是导致患者预后不良的主要原因。肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）在CRC的发生、转移和耐药中扮演核心角色，而Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是CSCs特性维持的关键驱动因素。尽管已知APC等基因突变导致β-catenin降解复合体功能丧失是CRC中Wnt通路亢进的主要原因，但E3泛素连接酶HUWE1在该过程中的调控机制及其对CRC干细胞特性和耐药性的影响尚不明确。

为解决这一问题，韩国天主教大学Sungjoo Kim Yoon团队在《Cell Death Discovery》发表了最新研究，系统揭示了HUWE1通过双向调控Wnt/β-catenin信号通路和线粒体功能，影响CRC干细胞特性与化疗敏感性的分子机制。

研究主要采用以下技术方法：利用慢病毒shRNA构建HUWE1稳定敲降的CRC细胞模型（DLD1、HT29、HCT116）；通过肿瘤球形成、集落形成、流式细胞术（CD24/CD133标记）评估干细胞特性；采用CCK-8、EdU染色、Transwell和伤口愈合实验分析增殖、侵袭与迁移能力；通过免疫共沉淀（Co-IP）、泛素化 assay和邻近连接 assay（PLA）验证蛋白互作；利用Western blot、免疫荧光检测关键蛋白表达与定位；基于TCGA数据库进行临床相关性分析；通过线粒体功能测定（ETC复合体活性、ATP水平）和药物蓄积实验探讨耐药机制。

HUWE1缺失增强CRC细胞的干细胞特性

研究人员在DLD1、HT29和HCT116细胞中敲降HUWE1后，发现肿瘤球形成能力、集落形成效率及CD24⁺/CD133⁺干细胞比例显著上升。同时，干性相关标志物（LGR5、OCT4、SOX2、NANOG）表达上调，且细胞对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶（5FU）和阿霉素的IC₅₀值升高，凋亡抵抗增强。

HUWE1缺失促进CRC细胞增殖、迁移、侵袭及EMT

HUWE1敲降细胞增殖速率加快，EdU阳性率升高，伤口愈合和Transwell侵袭实验显示迁移与侵袭能力增强。EMT标志物分析表明E-cadherin表达下降，N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug表达上升，细胞形态向间质表型转变。

HUWE1在β-catenin降解复合体功能障碍条件下调控Wnt/β-catenin信号

在APC突变型细胞（DLD1、HT29）中，HUWE1缺失导致β-catenin在胞核和胞质累积，下游靶基因c-Myc和Cyclin D1表达上调，且β-catenin泛素化水平降低。而在APC野生型细胞（如HCT116，携带β-catenin S45突变）中，HUWE1缺失同样引起β-catenin积累，但泛素化水平无显著变化。救援实验证实，回补野生型HUWE1（resHUWE1）可恢复β-catenin降解，而催化失活突变体（C4341S）无此效果。

HUWE1与β-catenin的互作依赖降解复合体功能状态

在APC突变细胞中，HUWE1主要与β-catenin结合并促进其泛素化；而在APC功能正常时，HUWE1转而与上游信号分子（Dvl、PPDPF）相互作用。PLA实验进一步验证了这一上下文依赖性的互作模式。

HUWE1回补逆转干细胞特性与恶性表型

回补resHUWE1可显著抑制HUWE1缺失细胞的肿瘤球形成、增殖、迁移、侵袭及干性标志物表达，并部分逆转EMT表型。在APC突变细胞中，APC回补也可部分逆转表型，但在β-catenin突变细胞中无效，证实HUWE1的作用不依赖于APC状态。

HUWE1缺失通过诱导线粒体生物合成导致耐药

HUWE1敲降细胞中线粒体生物合成关键调控因子（SIRT1、PGC1α、NRF2、TFAM）及电子传递链（ETC）复合体蛋白（NDUFB8、SDHB、UQCRC2、COXIV、ATP5A1）表达上升，ATP产量增加，ABC转运蛋白（ABCC1、ABCG2、ABCB1）表达升高，药物外排增强。抑制线粒体ATP合成（寡霉素）或ABC转运蛋白活性（Tariquidar）可恢复化疗敏感性。

HUWE1恢复增强化疗敏感性

回补resHUWE1可下调线粒体生物合成相关蛋白表达，降低ETC活性和ATP产量，减少ABC转运蛋白表达，从而显著降低IC₅₀值并增加化疗诱导的凋亡。

临床意义与机制模型

TCGA数据分析显示，HUWE1低表达与APC突变型CRC患者不良预后相关。研究最终提出双重调控模型：在β-catenin降解复合体功能失常时，HUWE1直接靶向β-catenin促进降解；在复合体功能正常时，HUWE1调控上游信号分子（Dvl、PPDPF）以精细调节Wnt通路活性。

该研究不仅阐明了HUWE1在CRC Wnt/β-catenin信号调控中的上下文依赖性功能，还揭示了其通过线粒体-ATP-ABC转运蛋白轴介导化疗耐药的新机制，为针对HUWE1缺失型CRC的靶向治疗提供了理论基础。