巨噬细胞胞外陷阱通过诱导肠道上皮细胞凋亡，损害小鼠DSS（二硝基磺酸盐）诱导的结肠炎中的肠道屏障功能

《Biochemical Pharmacology》：Macrophage extracellular traps impair intestinal barrier function in DSS-induced colitis in mice by inducing intestinal epithelial cell apoptosis

　　本研究发现PAD4介导的巨噬细胞外泌网（METs）在溃疡性结肠炎（UC）患者及DSS诱导小鼠中显著增加，通过激活cGAS-STING通路促进肠上皮细胞凋亡，破坏紧密连接蛋白表达，加重肠道炎症和屏障功能障碍。敲除PAD4可抑制MET形成，缓解结肠炎，提示PAD4-METs轴是UC治疗的新靶点。

　　

周子琪|苗欣宇|沈一鸣|王平|史瑞雅|范红叶|杨阳|郭敏|吴杰

中国药科大学生命科学技术学院，南京，中国

摘要

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病，其特征是结肠黏膜反复发炎，巨噬细胞在其发病机制中起着关键作用。最近，由肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）介导的巨噬细胞外陷阱（METs）被认为可能参与了炎症性疾病的发生。然而，METs具体如何促进UC的发展和进展仍不清楚。在本研究中，我们发现临床UC患者的结肠组织中存在大量METs。此外，我们发现DSS诱导的UC小鼠中METs的形成增加与结肠上皮细胞凋亡增加相关。通过RNA测序和Western blot分析，我们证明METs在MC38细胞中激活了cGAS-STING通路，导致细胞活力降低、凋亡增强以及紧密连接蛋白的表达减少，且这种效应具有剂量和时间依赖性。进一步地，基因敲除PAD4（该酶可抑制METs的形成）通过减少凋亡和增强屏障功能减轻了DSS诱导的结肠炎。我们的发现为PAD4介导的METs在UC进展中的作用提供了新的见解，并强调了其作为UC治疗靶点的潜力。

引言

炎症性肠病（IBD）的全球发病率正在上升，影响不同年龄段的多样化人群[1]。溃疡性结肠炎（UC）是IBD的一种亚型，其特征是结肠黏膜和黏膜下层反复发炎，主要影响30-40岁的成年人[2]。UC的潜在病因包括遗传因素、环境因素、菌群失调和免疫失调[3]。

巨噬细胞作为造血系统中多功能且动态的免疫细胞，在维持体内平衡、促进组织修复以及介导免疫监视和清除过程中起着核心作用[4]。它们在UC的发病机制中起着关键作用，表现为大量浸润结肠黏膜并持续暴露于慢性炎症刺激下[5]。细胞外陷阱（ETs），主要包括中性粒细胞外陷阱（NETs）和巨噬细胞外陷阱（METs），是由DNA、组蛋白、抗菌肽和蛋白酶组成的网状结构，能够将微生物捕获在粘性基质中[6]。尽管它们有许多共同点——例如主要的成分如瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶，这些成分都能捕获和杀死细菌——但也存在一些显著差异。例如，与NETs相比，METs在受到刺激后形成得更快，但需要更高浓度的刺激物[7,8]。除了抗菌功能外，异常的ETs形成越来越多地被认为通过促进上皮损伤、增强抗原暴露和持续慢性黏膜炎症而参与自身免疫病理[9]。METs已被发现与多种炎症性疾病有关，包括动脉粥样硬化（AS）、类风湿性关节炎（RA）和癌症[10],[11],[12],[13],[14]。我们之前的研究表明，结肠中过量的METs形成会加剧肠道炎症并促进1型糖尿病的进展[15]。然而，METs影响UC相关病理的具体机制仍不清楚。

许多研究指出NETs参与了UC的发病机制[16]。肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）对于细胞外陷阱（ETs）的形成至关重要。我们之前的研究发现，Cl-胺（PAD4抑制剂）或PAD4基因敲除可以减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的肠道炎症和屏障功能障碍[17]。为了阐明NETs和METs是否对UC的进展具有一致的影响，我们使用了DSS诱导的UC小鼠模型，并检测了结肠中NETs和METs标志物的时间动态。结果表明，NETs的形成在炎症早期达到高峰，而METs在后期占主导地位，这表明METs可能在驱动UC进展中起关键作用。

肠道屏障由上皮细胞、紧密连接和肠道黏膜系统组成[18]，它既是抵御肠道腔内有害物质的重要防线，又能促进营养吸收[19]。过度刺激肠道上皮细胞会引发异常凋亡，从而损害肠道屏障功能并持续慢性炎症，从而加重疾病进程[20]。巨噬细胞因其功能可塑性而能够在促炎和促修复两种表型之间转换，使其成为组织损伤和再生的关键调节因子[5]。研究表明，在某些条件下，METs可能导致组织损伤。例如，在横纹肌溶解症诱导的急性肾损伤模型中，血小板刺激的巨噬细胞会产生ROS，导致PAD4激活和METs形成增加，最终加重急性肾小管坏死[21]。

在本研究中，我们发现DSS诱导的结肠炎小鼠和UC患者的结肠组织中METs比NETs更常见，它们导致上皮损伤和疾病恶化。通过RNA测序、Western blot分析和PAD4基因敲除，我们发现了上皮细胞凋亡与METs之间的活跃相互作用，这种相互作用破坏了肠道屏障并促进了结肠炎的进展。我们的研究提供了有力证据，表明PAD4介导的METs形成是UC进展的关键决定因素。

研究片段

在UC患者和DSS诱导的结肠炎小鼠中观察到的METs形成增加

为了研究UC患者中METs的存在，我们对UC患者和健康对照组的结肠组织切片进行了免疫荧光（IF）染色。具体评估了瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3，METs的标志性标记）与CD68（成熟巨噬细胞的标记）的共定位，以确定组织内METs的形成和分布（图1A-B）。为了确定NETs（Ly6G + CitH3 +）和METs（F4/80 + CitH3 +）是否具有一致的作用

讨论

本研究阐明了PAD4介导的METs形成在UC进展中的关键作用。首先，我们观察到UC患者和DSS诱导的UC小鼠的结肠中存在大量METs，并且在UC的后期阶段METs比NETs更为普遍。此外，来自UC小鼠的腹腔巨噬细胞表现出更强的METs形成能力。我们还发现METs可以激活肠道上皮细胞中的cGAS-STING信号通路，从而促进凋亡

临床样本

一名UC患者和一名健康的男性对照组来自南京医科大学瑞润医院消化内科（南京，中国）。已获得知情同意，并且研究方案获得了机构伦理委员会的批准（2023-SR-S024）。

动物

从GemPharmatech有限公司获得了8-10周大的C57BL/6J雄性小鼠（20±2克），没有特定的病原体，以及它们的同窝PAD4 KO雄性小鼠。小鼠在恒定温度下饲养

写作过程中使用AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来改进语言表达。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

周子琪：概念化、方法论、写作——初稿。苗欣宇：概念化、方法论、写作——初稿。沈一鸣：方法论、软件应用。王平：方法论。史瑞雅：方法论。杨阳：方法论。郭敏：监督、写作——审阅与编辑。吴杰：监督、写作——审阅与编辑。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（项目编号81973224）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢贾莉和叶玉婷提供的病理技术支持。