《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Validated LC-MS/MS Method for Cisplatin Quantification in Plasma, Whole Blood, and Cervical Cancer Tissue via Diethyldithiocarbamate Derivatization: Clinical Application in Cervical Cancer
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定量分析技术；顺铂检测；LC-MS/MS方法学；宫颈癌药代动力学；组织分布研究
白洪浩|徐民教|崔秀妍|Khaowroongrueng Vipada|蔡允志|全智英|李顺英|金敏古|申光熙
韩国庆北国立大学药学院药物科学研究所，大邱 41566
摘要
本研究的目的是建立一种高灵敏度和选择性的LC-MS/MS方法，用于测定人血浆、全血和宫颈癌组织样本中的顺铂含量。该方法使用二乙基二硫代氨基甲酸酯（DDTC）作为顺铂的衍生化试剂，并采用多重反应监测（MRM）模式进行检测。该方法在血浆和组织中的定量下限（LLOQ）均为1 ng/mL，而在全血中的LLOQ为5 ng/mL。该方法表现出优异的线性（R2 >0.98）、精确度（变异系数<15%）和准确性（85%–115%），且在所有基质中均具有较小的基质效应。稳定性评估证实了该方法在冻融循环、短期储存和重新进样等条件下的稳健性。来自接受静脉注射40 mg/m2顺铂治疗1小时的宫颈癌患者的临床样本显示，血浆中的浓度范围为LLOQ以下至4,250 ng/mL，全血中为55–1,673 ng/mL，组织中为197–1,613 ng/mL。该方法的成功应用使得能够精确地进行顺铂的药代动力学和组织分布研究，从而有助于制定个性化的给药策略，以改善宫颈癌患者的治疗效果。
引言
基于铂的化疗药物，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂，在过去几十年中因具有强烈的细胞毒性而被广泛应用于临床肿瘤学[1]、[2]。顺铂主要通过诱导DNA交联、抑制DNA复制和触发细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用，这些机制是所有基于铂的药物的共同特点[3]、[4]、[5]。顺铂于1978年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，用于卵巢癌治疗，此后成为化疗的基本组成部分。它常用于宫颈癌、睾丸癌和生殖细胞恶性肿瘤的治疗[6]、[7]。然而，顺铂的临床应用受到其狭窄的治疗指数、累积毒性和个体间药代动力学变异性的限制。因此，开发高灵敏度和选择性的分析方法来监测生物基质中的顺铂水平对于优化治疗效果至关重要。
宫颈癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。顺铂通常作为一线化疗药物单独使用或与放疗联合使用[8]。尽管在临床实践中被广泛使用，但由于其狭窄的治疗窗口、剂量相关毒性和个体间显著的药代动力学差异，顺铂的治疗效果受到限制[9]、[10]、[11]。因此，具有高灵敏度和选择性的稳健分析方法对于准确测定生物基质中的顺铂含量以及实现治疗药物监测（TDM）至关重要[12]、[13]。
已有多种分析技术用于测定生物基质（如血浆、尿液和肿瘤组织）中的顺铂含量，包括电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、高效液相色谱与紫外-可见光谱法（HPLC-UV）以及原子吸收光谱[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。然而，这些技术常常受到基质干扰、选择性不足和分析物稳定性有限的问题，尤其是在复杂的生物基质中。最近的进展表明，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法结合衍生化技术，在复杂生物样本中能够提供更高的灵敏度和选择性[20]、[23]、[24]。二乙基二硫代氨基甲酸酯（DDTC）是一种非常有效的衍生化试剂，可形成稳定的Pt-DDTC复合物，显著提高检测的精确度和准确性。在优化条件下（40°C），DDTC与铂反应生成Pt-DDTC复合物，显著增强稳定性，并在正电喷雾离子化（ESI）模式下实现灵敏检测[15]、[25]、[26]。
全面了解药物在生物基质中的药代动力学特征和组织分布对于提高治疗效果和降低毒性至关重要。尽管顺铂被广泛使用，但目前尚未有经过验证的LC-MS/MS方法用于测定宫颈癌组织及相关血液样本中的顺铂含量，这突显了药代动力学研究中的一个关键空白。因此，本研究旨在开发并验证一种高灵敏度的LC-MS/MS方法，用于测定血浆、全血和宫颈癌组织中的顺铂含量，以支持药代动力学和组织分布分析。
材料
顺铂（纯度≥98%）由全北国立大学医院（韩国全州）提供。内标（IS）8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤（DPCPX）购自德国达姆施塔特的默克公司。为确保最佳的分析性能，还从默克公司购买了二乙基二硫代氨基甲酸酯三水合物（DDTC）、氢氧化钠（NaOH）以及LC-MS级别的溶剂——乙腈（ACN）、水和甲醇（MeOH）。此外，还准备了甲酸和醋酸铵。
血浆
根据先前建立的方法[14]、[25]进行优化后，将90 μL空白血浆准确移入1.5 mL Eppendorf管中，然后加入10 μL顺铂工作溶液。通过加入30 μL浓度为0.1 M（pH = 12.5）的25% DDTC并充分混合来启动衍生化反应。样品涡旋10分钟后，在40°C的加热块中孵育30分钟。随后加入20 μL内标（IS）。
LC-MS/MS方法优化
通过评估不同pH值的水性缓冲液和不同的有机溶剂（包括甲醇、乙腈及其组合），进行了一系列初步实验以优化流动相组成。在多种流速（0.2至0.5 mL/min）下，对多种色谱柱（包括Zorbax Eclipse Plus C18（100 × 2.1 mm, 1.8 μm）进行了评估。
最终优化的LC-MS/MS技术详见表S1。
结论
我们开发并验证了一种高灵敏度和选择性的LC-MS/MS方法，用于测定人血浆、全血和宫颈癌组织样本中的顺铂含量。与仅限于单一基质的先前方法不同，本研究通过在三种临床相关基质（包括肿瘤组织）中进行验证和临床应用，代表了技术的进步。通过使用DDTC衍生化，该方法在血浆和组织中的LLOQ分别为1 ng/mL，在全血中的LLOQ为5 ng/mL。
CRediT作者贡献声明
申光熙：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源准备、方法学设计、实验实施、资金获取、概念构思。Khaowroongrueng Vipada：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计。崔秀妍：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验实施。徐民教：撰写 – 审稿与编辑、实验实施、数据分析。白洪浩：撰写 – 初稿撰写、实验实施、数据分析、数据整理。金敏古：撰写 – 审稿与编辑、监督
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的支持，该基金由韩国科学技术信息通信部（MSIT）提供（项目编号RS-2023-00251397），以及通过韩国国家研究基金会（NRF）和教育部资助的BK21 FOUR项目（培育杰出研究型大学）的支持（项目编号2120240615414，医疗保健融合教育组，传染病管理方向）。
