一种用于同时定量人血浆中10种关键叶酸循环中间体的快速LC-MS/MS方法

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：A rapid LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of 10 key folate cycle intermediates in human plasma

　　叶酸代谢动态监测新方法及急性肾损伤代谢特征研究。采用HILIC-LC-MS/MS模式实现血浆中10种叶酸代谢物（含5种叶酸衍生物、4种氨基酸及B12）的快速同步检测（8.5min），方法验证显示高灵敏度（R2>0.989）、精密（1.3-14.6%）及良好回收率（89.5-113.8%）。临床研究表明AKI患者5-MTHF和Gly显著升高，并与SCr呈正相关（r=0.26,0.04；r=0.27,0.04）。该技术为代谢紊乱研究及叶酸相关疾病防治提供新工具。

　　这项研究聚焦于叶酸循环中关键代谢物的分析方法优化，旨在提升检测效率与准确性，为临床代谢疾病的研究提供更可靠的技术支持。叶酸循环是调节代谢过程的重要机制，它不仅参与一碳单位的转移，还在维持细胞功能、DNA合成以及神经系统的正常运作中发挥关键作用。然而，目前针对叶酸循环代谢物的检测方法存在一些局限性，特别是在使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术时，某些高度极性的化合物在反相色谱分离过程中表现出较差的保留性能，导致分析时间较长，通常超过30分钟。此外，传统的检测方法往往无法同时监测多个叶酸衍生物及其他相关成分，限制了对代谢紊乱的全面评估。

为了克服这些技术瓶颈，研究人员开发了一种基于亲水相互作用液相色谱（HILIC）模式的新方法，能够同时检测10种关键的叶酸循环代谢物，包括5种叶酸衍生物、4种相关氨基酸以及一种辅因子——维生素B12（VB12）。这一方法在不进行衍生化处理的情况下，显著提高了代谢物的保留性能，并将分析时间缩短至8.5分钟。这样的改进不仅提升了检测效率，还降低了实验操作的复杂性，使得该方法在临床应用中更具可行性。

在方法验证过程中，研究人员对所有目标分析物的线性范围、精密度、回收率以及基质效应进行了详细评估。结果显示，所有分析物的线性关系良好，相关系数R2均大于0.989，表明该方法具有高度的准确性。精密度方面，日内和日间变异系数分别控制在1.3-11.3%和3.4-14.6%之间，符合临床检测的标准。回收率在89.5-113.8%的范围内，显示出良好的提取效率。基质效应也得到了有效控制，数值在81.6-115.8%之间，表明样品基质对检测结果的影响较小，有助于提高检测的稳定性与可靠性。

进一步的稳定性测试表明，所有叶酸循环中间体在5°C下可稳定保存5小时，在-40°C下可稳定保存12小时，在-80°C下可稳定保存24小时。这一结果对于临床样本的储存与运输具有重要意义，确保了实验数据的准确性与可重复性。同时，该方法在实际临床样本中的应用也验证了其有效性，特别是在对急性肾损伤（AKI）患者的血浆样本进行分析时，发现与非AKI对照组（NAKI）相比，AKI患者的5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）和甘氨酸（Gly）水平显著升高。这一发现提示叶酸代谢可能在AKI的发生与发展中扮演重要角色，为相关疾病的机制研究提供了新的视角。

通过相关性分析，研究人员还发现血清肌酐（SCr）水平与5-MTHF和半胱氨酸（hCys）浓度之间存在显著的正相关关系（r = 0.26, p = 0.04 和 r = 0.27, p = 0.04）。这一结果表明，叶酸代谢的改变可能与肾脏功能的下降存在某种联系，为探索AKI的代谢标志物提供了新的线索。此外，5-MTHF在将同型半胱氨酸（hCys）转化为蛋氨酸（Met）的过程中起着关键作用，而Met又进一步转化为S-腺苷蛋氨酸（SAM），这是细胞内重要的甲基供体，参与表观遗传调控和细胞稳态维持。因此，叶酸代谢的异常可能对SAM的生成产生影响，从而影响细胞的正常功能。

这项研究的创新之处在于采用HILIC模式的LC-MS/MS方法，不仅提高了分析效率，还实现了对多种叶酸代谢物的同时检测。相比传统的反相色谱方法，HILIC模式在分离极性化合物方面表现出更优的性能，能够有效避免某些代谢物在色谱过程中过早洗脱的问题。同时，HILIC模式的使用也减少了对样品预处理的依赖，简化了实验流程，提高了检测的便捷性。这些优势使得该方法在临床研究中具有更高的应用潜力，特别是在需要快速、准确检测叶酸循环代谢物的场景下。

此外，研究团队还对不同色谱柱的性能进行了比较，包括反相色谱柱（BEH C18和HSS T3）以及HILIC柱（BEH Amide）。结果显示，HSS T3和C18色谱柱在分离叶酸衍生物方面表现出良好的效果，而HILIC柱则在缩短分析时间、提高保留性能方面具有显著优势。通过优化色谱条件，研究人员成功实现了对10种目标代谢物的高效分离与检测，为后续的临床研究提供了坚实的技术基础。

在实际应用中，该方法被成功应用于对住院AKI患者与NAKI对照组的血浆样本进行分析，揭示了叶酸代谢在AKI中的异常变化。这种变化不仅为AKI的发病机制提供了新的证据，也为其他与叶酸代谢相关的疾病，如巨幼红细胞性贫血和神经管缺陷的诊断与治疗提供了潜在的参考依据。随着对叶酸循环研究的深入，越来越多的证据表明叶酸代谢的紊乱可能与多种疾病的发生发展密切相关，因此，建立一种高效、准确的检测方法对于推动相关领域的研究具有重要意义。

从临床角度来看，叶酸循环的异常可能与多种疾病状态相关，包括贫血、神经系统疾病以及心血管疾病等。因此，能够快速、准确地检测叶酸代谢物的水平，有助于医生对患者进行更精准的诊断与干预。例如，在巨幼红细胞性贫血的诊断中，叶酸水平的检测是重要的依据之一，而该方法的开发为这一检测提供了更高效的手段。此外，在神经管缺陷的预防中，叶酸的补充被认为是关键措施之一，而对叶酸代谢物的全面监测有助于评估个体的叶酸营养状况，从而制定更个性化的干预方案。

研究团队在方法开发过程中也考虑到了实验操作的规范性与伦理问题。研究方案已获得北京大学第三医院药学部的伦理审批（批准号：IRB00006761-M2020296），并得到了所有参与研究的患者或其代理人的书面知情同意。这表明研究过程符合伦理规范，确保了实验数据的科学性与可靠性。同时，研究团队还获得了多项资金支持，包括国家自然科学基金、北京市自然科学基金以及北京大学第三医院的重点临床项目，这些支持为研究的顺利开展提供了必要的资源保障。

总的来说，这项研究通过开发一种基于HILIC模式的LC-MS/MS方法，实现了对叶酸循环中关键代谢物的高效、准确检测。该方法不仅提高了分析效率，还克服了传统方法在保留性能与分析时间方面的不足。通过在临床样本中的应用，研究人员揭示了叶酸代谢在AKI中的异常变化，为相关疾病的机制研究与临床诊断提供了新的思路。未来，随着该方法的进一步推广与优化，有望在更多代谢疾病的研究中发挥重要作用，为精准医学的发展贡献力量。