诺卡酮（nootkatone）在抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抗菌活性及NorA和MepA外排泵方面的作用评估

《The Microbe》：Evaluation of nootkatone in the antibacterial activity and inhibition of the efflux pumps NorA and MepA in Staphylococcus aureus strains

　　本研究评估了诺卡酮对表达NorA和MepA泵的金黄色葡萄球菌菌株的抗菌作用，发现其能降低氟喹诺酮类药物的MIC值，并通过荧光法证实抑制NorA泵的效果，为开发新型抗生素增效剂提供了依据。

　　微生物在自然界中广泛存在，它们不仅能够存在于空气、土壤和水体中，还能够与人类共生，形成人体内的正常菌群。这些微生物在皮肤、口腔、呼吸道、肠道、生殖系统和泌尿系统中都有分布。除了作为共生菌外，某些微生物也具有致病性，能够在特定条件下引发感染。随着抗生素的滥用和过度使用，一些细菌逐渐演化出多重耐药性（Multidrug-Resistant, MDR），这已成为全球公共卫生领域的重要挑战。由于这些耐药菌株的出现，传统的抗生素治疗手段变得效果有限，甚至失效，从而增加了感染的严重性和死亡率。

在这种背景下，寻找能够增强现有抗生素疗效或替代传统抗生素的新物质成为研究的重点。许多天然产物，尤其是植物来源的生物活性化合物，因其在抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化等方面的潜力而受到关注。这些天然化合物不仅能直接抑制细菌的生长，还可能通过干扰细菌的耐药机制来提高抗生素的疗效。其中，一些化合物能够抑制细菌的外排泵系统，从而减少抗生素被排出体外，提高其在细胞内的浓度，增强杀菌效果。

外排泵是细菌细胞膜上的跨膜蛋白，它们在细菌的生理功能和耐药性中扮演着关键角色。外排泵能够主动将抗生素、生物杀灭剂和其他外源性物质从细胞内泵出，降低这些物质在细胞内的有效浓度，从而导致抗生素治疗效果减弱。因此，针对这些外排泵的抑制剂研究成为克服细菌耐药性的有效策略之一。目前，已知的外排泵家族包括ATP结合盒（ABC）系统、小多药耐药（SMR）家族、多药和毒物外排（MATE）家族、主要促进因子超家族（MFS）、耐药-结节-分化（RND）家族以及蛋白细菌抗菌化合物外排（PACE）家族。其中，MFS和MATE家族中的NorA和MepA蛋白外排泵在某些细菌中被广泛研究，它们对多种抗生素的外排作用尤为显著。

在这一研究领域中，Nootkatone作为一种天然的倍半萜类化合物，因其广泛的生物活性而备受关注。Nootkatone来源于柑橘类水果，特别是葡萄柚（Citrus paradisi）的精油中，具有抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化等多种功能。近年来，已有研究表明Nootkatone在对抗耐药细菌方面具有潜力，特别是在抑制外排泵系统方面表现出良好的效果。这使得Nootkatone成为一种可能用于改善抗生素治疗效果的新型辅助药物。

本研究旨在评估Nootkatone对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株的抗菌作用，包括那些表达NorA和MepA外排泵的菌株。通过使用微量肉汤稀释法（broth microdilution method），研究人员测定了Nootkatone单独使用以及与氟喹诺酮类抗生素（如诺氟沙星和环丙沙星）联合使用时的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。同时，研究还评估了Nootkatone对乙醚溴化乙锭（Ethidium Bromide, EtBr）这种标准外排泵底物的抑制作用，以进一步探讨其对外排泵的潜在影响。

实验结果显示，Nootkatone对金黄色葡萄球菌K2068菌株表现出内在的抗菌活性，其MIC为203 μg/mL。然而，对于ATCC 29213和1199菌株，Nootkatone并未表现出显著的抗菌作用，其MIC均大于等于1024 μg/mL。这表明不同菌株对外排泵的表达水平可能存在差异，进而影响Nootkatone的抗菌效果。进一步的实验发现，当Nootkatone与诺氟沙星联合使用时，其能够显著降低这两种菌株的MIC值，分别降低了约87.5%和92.1%。这一结果提示Nootkatone可能通过抑制外排泵系统，从而增强抗生素的抗菌效果。

此外，Nootkatone在与EtBr结合时，也表现出对金黄色葡萄球菌1199菌株的外排泵抑制作用，其MIC降低了约60.2%。这种外排泵的抑制效应可以通过荧光测量进一步验证。EtBr是一种能够与DNA结合的荧光染料，当其被外排泵排出时，其在细胞内的浓度会降低，导致荧光信号减弱。然而，当Nootkatone存在时，EtBr的荧光信号显著增强，这表明其可能抑制了外排泵的活性，从而增加了EtBr在细胞内的积累。这一结果与之前的MIC实验结果相互印证，进一步支持了Nootkatone作为外排泵抑制剂的潜力。

在实验过程中，研究人员还使用了标准的外排泵抑制剂CCCP（Carbonyl Cyanide 3-chlorophenylhydrazone）作为对照，以验证实验结果的可靠性。CCCP在抑制外排泵方面具有显著效果，其与EtBr或抗生素结合时，能够显著提高MIC值，表明其有效抑制了外排泵的活性。相比之下，Nootkatone在降低MIC值和增强EtBr荧光信号方面表现出相似的效果，进一步支持其作为外排泵抑制剂的潜力。

通过这些实验，研究人员发现Nootkatone不仅能够直接抑制某些金黄色葡萄球菌菌株的生长，还能够通过抑制外排泵系统，增强抗生素的抗菌效果。这种双重作用机制可能为开发新的抗菌策略提供重要依据。在当前抗生素耐药性问题日益严重的背景下，Nootkatone的这些特性使其成为一种有潜力的新型抗菌剂，尤其适用于那些表达外排泵系统的耐药菌株。

然而，尽管Nootkatone表现出良好的抗菌和外排泵抑制效果，其具体的作用机制仍需进一步研究。分子生物学和基因敲除实验可以帮助更深入地理解Nootkatone如何影响细菌的耐药性，以及其是否能够通过其他途径（如改变细胞膜通透性或影响抗生素靶点）发挥作用。此外，还需要探讨Nootkatone在不同细菌种类中的普遍适用性，以及其在实际临床应用中的安全性和有效性。

综上所述，Nootkatone作为一种天然的倍半萜类化合物，不仅具有直接的抗菌作用，还可能通过抑制外排泵系统，增强抗生素的抗菌效果。这些发现为开发新的抗菌策略提供了理论支持和实验依据，尤其是在应对多重耐药细菌的挑战方面。未来的研究应进一步探索Nootkatone的作用机制，评估其在不同细菌中的抗菌效果，并探讨其在临床中的应用潜力。