雄激素受体基因变异与绝经后女性衰弱表型的关联研究：一项基于人群的横断面分析

　　本研究通过多变量有序回归分析，探讨了雄激素受体（AR）基因单核苷酸多态性（SNPs）与绝经后女性衰弱表型的关联。尽管所选SNPs（rs5919427与rs2497942）未呈现显著统计学意义，但研究揭示了年龄、BMI、分娩史和共病数量等指标与衰弱状态的独立相关性，为女性健康衰老机制研究提供了新的分子流行病学视角。

　　

Abstract

流行病学证据表明衰弱与绝经年龄存在关联。具有合成代谢特性的雄激素可能是导致衰弱的关键因素。本研究旨在阐明雄激素受体（AR）基因中的单核苷酸多态性（SNPs）是否与衰弱相关。研究基于社区居住的绝经后女性人群样本中的衰弱亚队列进行横断面分析，选取了两个可能调节AR功能的AR基因SNPs位点，采用多项有序回归模型估计表型变异。最终纳入392名女性（平均年龄64.1岁），衰弱状态分布为29.6%衰弱、38.5%前衰弱和31.9%健康，与此年龄段的基于人群数据一致。两个选定的AR基因SNPs（rs5919427和rs2497942）均未显示与衰弱状态存在统计学显著关联。年龄、生殖因素（包括分娩和流产次数）、共病数量和体重指数（BMI）与衰弱独立相关。需要进一步研究以全面探索AR基因变异在衰弱易感性中的潜在作用。

Introduction

健康衰老是当代社会面临的重要议题，随着预期寿命的持续延长，衰弱状态尤为值得关注。衰弱表现为生理储备和稳态下降的脆弱状态，且在女性中更为普遍。临床研究表明，衰弱与绝经年龄存在负相关关系，但其机制尚未明确。卵巢类固醇激素在绝经过渡期间循环水平发生显著波动，可能是介导这一过程的重要因素。除了雌激素的急剧下降外，雄激素因其对肌肉的合成代谢作用而备受关注，尤其是握力和步速这两个弗里德衰弱表型评估量表的关键组成部分均受肌肉功能影响。

类固醇激素通过与其特异性受体相互作用介导生理效应，受体功能受多种因素调节，包括共激活因子与共抑制因子的平衡以及受体本身的基因多态性。本研究团队先前已探讨雌激素受体（ER）基因SNPs是否调节雌激素活性，从而为绝经期间雌激素介导的衰弱进展提供证据。虽然结果呈阴性，但该研究视角促使我们将研究扩展至雄激素受体（AR）基因SNPs，旨在阐明累积雄激素刺激在绝经与衰弱交互作用中的潜在差异。本研究调查了AR基因中两个精选的SNPs位点（基于其对基因功能的强影响潜力）与社区居住绝经后女性衰弱水平的关联。

Methods

研究招募2018年1月至2020年2月期间在初级保健中心或大学医院门诊进行常规健康检查的女性，纳入慢性病减少绝经后研究（CARMEN）队列。共1207名女性在签署知情同意书后入选。 eligibility criteria包括自然或手术绝经，自然绝经定义为至少一年闭经，并经促卵泡激素（FSH）水平≥30 mIU/mL和雌二醇（E2）浓度处于实验室设定的绝经后参考范围内进一步确认。从循环白细胞中提取DNA用于遗传分析。

选取587名女性组成衰弱评估亚队列。排除标准包括：（i）预期寿命不足一年；（ii）严重感觉缺陷；（iii）神经系统疾病如痴呆或神经运动功能受损。鉴于绝经激素治疗（MHT）可能影响衰弱状态，当前及既往MHT使用者也被排除。研究经机构审查委员会批准（注册号160728），所有参与者签署书面知情同意书。

衰弱状态采用弗里德量表评估，应用所有五项标准：非故意体重减轻（过去一年减重超过4.5公斤）、自我报告 exhaustion、握力减弱（使用Jamar测力计测量主导手的三次测试平均值）、4.57米行走速度缓慢以及低体力活动（采用西班牙语版明尼苏达休闲时间体力活动问卷简短版评估）。参与者分为三类：健康（未满足任何标准）、前衰弱（满足一或两项标准）和衰弱（满足三项及以上标准）。

社会人口学 profile方面，由于 universal healthcare system coverage，假设CARMEN队列中的女性代表当地社会经济谱系，但无法排除较高社会阶层代表性不足的可能性。社会阶层根据两个主要收入指标自我报告：覆盖基本需求的能力以及储蓄和/或承担非必要支出的能力。教育程度分为四个层级：无认证学历、小学、中学和大学。饮食 habit以地中海饮食为主，就业方面大多数参与者自称家庭主妇。

代谢参数（包括葡萄糖和血脂水平）使用全自动分析仪（Olympus AU5400）进行血清分析。血脂谱包括总胆固醇（TC，mg/dL）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，mg/dL）和甘油三酯（TG，mg/dL）。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）通过Friedewald公式计算（LDL-C = TC ? (HDL-C + TG/5)），前提是TG水平低于400 mg/dL。血液学参数使用Sysmex XN?1000分析仪测量。FSH和E2水平通过电化学发光法（E170 Modular Analyzer）测定。维生素D水平使用Elecsys Vitamin D Total Assay定量，通过电化学发光结合程序测量25-羟基维生素D [25(OH)D]。

SNP选择与基因分型方面，AR基因位于X染色体上一个具有显著连锁不平衡的区域。为捕获最大遗传变异，我们选择了在西班牙伊比利亚人群中小等位基因频率（MAF）>5%的两个SNPs。根据GRCh38基因组组装，SNP rs5919427位于67783742位置，代表NXTAR基因的内含子变异（AR基因上游）。SNP rs2497942位于AR基因下游（位置67345829）。尽管选定的SNPs距离较远，它们仍显示显著的连锁不平衡（D': 0.7619, R2: 0.5378）。此外，这两个选定的SNPs在多个表达AR基因的组织中被列为eQTL（表达数量性状位点），并在若干全基因组关联研究（GWAS）中显示显著性。DNA提取如先前所述，通过等位基因 discrimination使用Taqman SNP Genotyping Assays在QuantStudio 5 Real-Time PCR系统上进行基因分型。

统计分析采用多项有序回归模型评估序数因变量（衰弱）与独立协变量和因素之间的关联。模型提供定义序数因变量相邻类别之间过渡点的阈值参数。评估了四种链接函数（Logit、Negative Log-Log、Cauchit和Probit）的性能，确定Logit为最佳模型拟合链接函数。对于协变量，正或负系数表示自变量与结果之间的正或负关系。对于因素，较大系数的因素水平表示处于较高累积结果类别的概率较大。应用平行线检验评估位置参数在因变量各水平是否相等的假设，并使用Pearson卡方拟合优度检验评估观测数据与拟合模型的一致性。统计学显著性设定为0.05，数据分析使用IBM SPSS Statistics for Windows（版本28.0）进行。

Results

最终纳入392名具有完整临床（衰弱）和分析参数数据的女性。队列的临床、人体测量和人口学数据按衰弱状态和整体呈现。约三分之一女性被分类为衰弱，与西班牙人群的比率一致。大多数女性处于绝经后期（STRAW+10），平均年龄64.1岁（标准差7.5），绝经后平均9.4年（标准差7.1）。她们略微超重，平均BMI为26.1±4.1 kg/m2。大多数女性（87.0%）有孩子，两次分娩最为常见。共114名女性（29.1%）符合 multimorbidity（≥2种非传染性疾病）标准，与同龄女性一般人群的预期比率相似。最常见的 morbid conditions（患病率≥2%）包括高血压、血脂异常、骨质疏松、骨关节炎、抑郁症、2型糖尿病、甲状腺功能减退和癌症存活者。社会经济 profile显示中等偏低教育水平，收入 strata分布相对均衡。

实验室参数显示，血液学参数处于正常参考范围内，代谢 profile表明中度高脂血症，TC和LDL-C水平略高于实验室定义的正常上限（分别为200 mg/dL和130 mg/dL）。根据纳入标准，FSH和E2水平符合绝经后生理范围。队列中25(OH)D平均浓度为26.8±13.1 ng/mL，处于美国医学研究所设定的正常范围内。任何血液学、血脂、激素和维生素D参数在衰弱类别间均未观察到统计学显著差异。

多变量有序回归分析参数估计显示，年龄和BMI分别具有显著负（-0.028）和正（0.051）斜率系数（p=0.021）。生殖史方面，有0、1或2个孩子的女性显示负斜率系数；仅有一个孩子的女性与参考组（≥3次分娩）相比达到统计学显著性（斜率=-0.964, p=0.001）。此外，未经历流产（斜率=-0.959, p=0.015）或无共病（斜率=-0.564, p=0.012）的女性更可能被分类到较轻衰弱组别，分别与≥2次流产或≥2种共病的女性相比。平行线检验显著性较高（p=0.722），无法拒绝位置参数在三个衰弱类别相同的零假设。Pearson卡方拟合优度检验的显著性值不显著（p=0.309），表明应用的序数回归模型良好拟合数据。

Discussion

本研究探讨了AR基因等位基因变异的不同表达是否与绝经后女性衰弱表型相关。流行病学证据表明衰弱风险与绝经年龄在不同地理区域（包括加拿大、英国和韩国）存在负相关，两项系统评价（其中一项包含荟萃分析）证实了这种负相关。这些数据为生殖激素可能影响衰弱调节的假设提供了基础，鉴于卵巢激素产生的急剧下降是伴随绝经的生理改变的主要驱动因素。这一议题因衰弱在健康衰老中的关键作用而备受关注，但仍未充分探索。重要的是，我们的数据避免了测量循环激素浓度的局限性，这对雄激素尤为重要。

虽然一些研究探讨了雌激素水平下降是否可能导致衰弱，但有限的证据并不支持这一假设。在此背景下，雄激素成为合理候选者，因其对脊椎动物肌肉细胞的营养作用，考虑到肌肉功能在衰弱中的核心作用。与此一致，游离和总睾酮水平已在两项荟萃分析中被确定为衰弱的生物标志物。

在人类中，雄激素对肌肉的合成代谢作用由睾酮介导，其通过AR刺激蛋白质合成和通过 intramuscular IGF-1 pathway间接促进肌肉质量增加。这些过程有助于增加肌纤维横截面积和卫星细胞增殖。然而，男性雄激素替代治疗的纵向临床试验仅产生 modest benefits。

有趣的是，新出现的证据表明雄激素在女性中可能具有 distinct effects。单细胞转录组分析提供了对雄激素性别特异性作用的见解。与这些观察一致，临床研究通常未能证明雄激素在女性中具有明确的合成代谢作用。一项对10项观察性研究（仅两项为纵向）的系统评价发现总睾酮与肌肉质量、力量或性能之间没有一致关联。评估计算游离或生物可利用睾酮的研究报告与 lean mass正相关，但与肌肉力量或性能无关。方法学问题，特别是免疫测定的使用以及游离和生物可利用睾酮测量的有限准确性已被 noted。这与前述荟萃分析的结论一致，这些分析确定了睾酮（总睾酮和游离睾酮）与男性衰弱的关联，但女性中未发现。

鉴于这些不一致性，我们试图确定AR相关遗传变异的功能调节是否可能影响衰弱。我们分析了先前描述的AR基因变异，选择了两个满足关键标准的SNPs：rs5919427和rs2497942，这些标准包括（i）在伊比利亚人群中的MAF >0.15；（ii）被分类为AR基因的eQTL；（iii）在伊比利亚人群中彼此之间最低的 pairwise连锁不平衡；以及（iv）先前在GWAS中与雄激素相关表型的关联。值得注意的是，rs5919427与脱发相关，而rs2497942与空腹胰岛素水平相关。

我们的研究结果 contribute to the growing literature on frailty and menopause。潜在背景显得复杂，研究仍稀疏，可能超出 solely hormonal influences的机制。尽管受限于检查的特定基因组区域，我们的分析调查了两个与AR功能相关的SNPs。此外，观察到的衰弱与生殖事件（如产次和流产史）之间的关联突出了复杂、多因素的相互关系，值得深入探索。

总之，我们提供了关于AR基因功能 profile在衰弱中潜在 implications的新证据。虽然我们的研究未产生统计学显著关联，但其他SNPs的可能 involvement值得进一步探索。针对性调查雄激素效应可以增强我们对衰弱性别特异性决定因素的理解，对女性健康（特别是在绝经后环境中）具有重要 implications。

Acknowledgements

我们向参与者表示衷心感谢，他们的 commitment对研究的成功完成至关重要，并向Rosa Aliaga女士和Loreto Suay女士在实验室中的宝贵技术支持致谢。

Author contributions

Aitana Monllor-Tormos：研究设计与构思、调查、数据方法与分析、文档初稿及后续版本起草。Miguel A. García-Pérez、Alicia García-Vigara、Arturo Artero和Juan J. Tarín：统计分析、实验室结果解释、文献综述、审阅与编辑以及高级科学输入。Alicia García-Vigara：数据分析、审阅与编辑。Antonio Cano：研究设计与构思、资金获取、调查、数据方法与分析、文档初稿及后续版本起草。所有作者 critically revised并接受最终文档版本。

Funding

欧洲委员会资助（资助缩写FOCUS，资助协议号664367）。

Data availability statement

支持本手稿的数据保存在瓦伦西亚大学的数据库中，可能经INCLIVA研究所伦理委员会事先授权后提供。