循环肿瘤DNA（ctDNA）作为生殖细胞肿瘤分子残留病预后生物标志物的纵向评估研究

　　本文前瞻性评估了肿瘤知情（tumor-informed）ctDNA检测在生殖细胞肿瘤（GCT）患者中的预后价值。研究发现，术后分子残留病（MRD）及监测期ctDNA阳性与显著较差的无事件生存期（EFS）相关（HR分别为5.11和12.45），其预测效能优于传统血清肿瘤标志物（STMs）。研究结果支持ctDNA作为GCT患者风险分层和治疗决策的新型敏感生物标志物，具有重要临床转化潜力。

　　

研究背景与意义

生殖细胞肿瘤（GCT）虽仅占男性恶性肿瘤的1%，却是15–35岁男性中最常见的癌症。目前其诊断、分期及监测主要依赖影像学检查和血清肿瘤标志物（STMs），包括甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素（βhCG）和乳酸脱氢酶（LDH）。然而，这些标志物存在显著局限性：AFP在肝病或肝癌中可能假性升高；βhCG与黄体生成素存在交叉反应，且在多种良恶性状况中均可异常；LDH则是非特异性标志物，可在任何细胞快速更新状态下升高。更重要的是，高达40%的GCT患者（尤其是精原细胞瘤）的STMs始终正常，这凸显了对高灵敏度、高特异性生物标志物的迫切需求。

循环肿瘤DNA（ctDNA）是一种新兴的、微创的液体活检生物标志物。检测方法主要分为肿瘤未知（tumor-na?ve）和肿瘤知情（tumor-informed）两种策略。后者通过先对肿瘤组织进行测序，进而定制化地监测患者特有的体细胞突变，从而在多种实体瘤中展现出卓越的灵敏度与特异性，被用于分子残留病（MRD）检测、复发监测和治疗反应评估。然而，其在GCT中的应用数据仍十分缺乏。

研究设计与方法

本研究是一项多机构回顾性研究，旨在评估肿瘤知情ctDNA分析在GCT患者中的效用。研究纳入了74例临床I–III期GCT患者，共分析了324份血浆样本。采用的检测技术为经过临床验证的、个性化的16重多重PCR-NGS assay（Signatera，Natera Inc.）。其工作流程是：首先对患者的肿瘤组织（FFPE样本）和匹配正常血液样本进行全外显子组测序（WES），据此为每位患者选定最多16个体细胞单核苷酸变异（SNVs），并设计多重PCR引物用于后续血浆ctDNA的超高深度测序。若检测到≥2个SNVs超过预设的统计学置信阈值，则判定为ctDNA阳性。ctDNA浓度以每毫升血浆平均肿瘤分子数（MTM/mL）报告。

ctDNA在不同时间窗口进行评估：

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  睾丸切除术前（Preorchiectomy）
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  分子残留病（MRD）窗口：术后1–12周，且在任何主要治疗（化疗或RPLND）开始前
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  监测（Surveillance）窗口：术后>12周（未接受辅助治疗者），或化疗后，或RPLND后

研究的主要终点是ctDNA状态与无事件生存期（EFS）的相关性。EFS定义为从睾丸切除术到影像学复发或任何残留/持续疾病证据的时间。次要终点包括ctDNA检出率、ctDNA状态与RPLND或化疗后EFS的关联。

研究结果

患者特征与ctDNA总体检出率

纳入的74例患者中位年龄为34岁，中位随访时间为17个月。41%为临床I期，69%为非精原细胞瘤。术后管理策略包括：单纯监测（23%）、化疗（41%）、RPLND（7%）以及化疗联合RPLND（29%）。

在睾丸切除术前的15例患者中，ctDNA检出率高达93.3%（14/15），其中I期、II期和III期疾病的检出率分别为91.6%、100%和100%，表明该技术在疾病早期即具有高灵敏度。

MRD窗口：ctDNA阳性预示显著更差的EFS

在MRD窗口（N=42）中，ctDNA阳性患者（50%）的EFS显著差于阴性患者（中位EFS：5.36个月 vs 未达到[NR]）。经分期和组织学调整后的风险比（HR）为5.11（95% CI: 1.31–19.95; P=0.019）。相比之下，同期STM升高（57.9%）与正常者之间的EFS无显著差异（中位EFS：24.8个月 vs NR; HR=2.97; P=0.149）。

值得注意的是，在5例含有纯畸胎瘤成分且拥有MRD窗口数据的患者中，有2例检测到ctDNA。鉴于纯畸胎瘤对化疗不敏感，其术后ctDNA阳性状态或可为是否需要额外治疗提供关键决策信息。

监测窗口：ctDNA持续展现强大预后价值

在监测窗口（N=51）中，ctDNA阳性患者（25.5%）的EFS同样显著缩短（中位EFS：4.83个月 vs NR），调整后HR高达12.45（95% CI: 4.32–35.85; P<0.0001）。而STM状态在此窗口依然无法显著区分预后（HR=1.74; P=0.194）。

对特定亚组的分析进一步证实了ctDNA的价值：

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  在6例接受RPLND的II期患者中，术后ctDNA阳性者（n=2）的EFS极差（HR=15.11; P=0.018）。
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  在42例接受一线化疗的II/III期患者中，化疗后ctDNA阳性（n=22）与EFS显著恶化相关（HR=6.91; P=0.004），而化疗后STM状态则无此预测能力。

ctDNA动态变化与治疗反应

对14例在MRD和监测窗口均有数据的II/III期患者进行纵向分析发现，ctDNA状态演变与临床结局高度一致：ctDNA持续阴性或由阳转阴的患者（n=9）中，33.3%发生事件；而ctDNA持续阳性的患者（n=5）全部（100%）发生事件。

此外，在MRD窗口阳性且接受化疗的13例患者中，58.8%（7/13）在化疗后实现了ctDNA清除。其余6例未清除者，其ctDNA水平（MTM/mL）相较于MRD时点也中位下降了96.5%，反映了治疗带来的分子水平缓解。

ctDNA与STM的联合分析

在MRD窗口，生物标志物状态不一致的患者（n=9）中，ctDNA阴性/STM阳性者复发率较低（1/6），而ctDNA阳性/STM阴性者已有复发（1/3）。

在监测窗口，这种分化更为惊人：所有ctDNA阳性/STM阴性患者（n=7）全部复发，而所有ctDNA阴性/STM阳性患者（n=3）均未复发。这强有力地证明，在监测阶段，ctDNA的预后预测价值远优于STM，其阳性结果能精准识别出存在微小残留病灶的高复发风险患者。

讨论与结论

本研究提供了初步证据，支持将ctDNA作为一种新型预后生物标志物用于GCT管理。其优势在于：相较于STMs（AFP半衰期5–7天，βhCG半衰期24–36小时），ctDNA的半衰期极短（6分钟至13小时），能近乎实时地动态反映肿瘤负荷和分子异质性。

研究发现具有多重临床意义：

1. 1.
   风险分层与辅助治疗决策：术后MRD期的ctDNA阳性可识别出高复发风险患者，有助于筛选出真正需要辅助化疗的人群，避免多数低风险患者承受不必要的治疗毒副作用。
2. 2.
   治疗后评估：对于化疗或RPLND后存在残留肿块的患者，目前缺乏有效手段鉴别坏死组织、畸胎瘤或活性GCT。本研究显示，治疗后ctDNA状态是预测预后的强有力指标，未来或可指导是否需要进行挽救性手术。
3. 3.
   与其它新型标志物的互补：microRNA-371a-3p是GCT领域另一新兴标志物，其优势在于无需肿瘤组织。而肿瘤知情ctDNA检测可能提供互补信息，共同提升疾病监测的准确性。

本研究的局限性在于其回顾性设计和治疗、检测时点的不统一。此外，队列中包含约10%的纯畸胎瘤患者，其生物学行为和治疗策略不同于经典GCT，引入了异质性。尽管如此，研究结果依然显著。结论认为，纵向ctDNA监测有望优化GCT患者的风险分层，减少辅助治疗中的过度治疗，从而保护患者免受长期不良反应，最终提高生活质量。有必要在更大规模的前瞻性临床试验中进一步验证其临床效用。