评估具有临床相关性的药物作为猫P-糖蛋白底物的潜力

《Frontiers in Veterinary Science》：Assessment of clinically relevant drugs as feline P-glycoprotein substrates

　　药物安全性评估：通过竞争排泄试验和CRFK细胞系分析13种猫用药物P-gp底物状态，发现eprinomectin、cyclosporine等10种为P-gp底物，3种非底物。研究为预防P-gp缺乏猫的药物相互作用提供依据。

　　药物转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）在药物的体内分布中起着至关重要的作用。它通过限制药物进入中枢神经系统（CNS）并增强胆汁排泄，从而在哺乳动物中影响多种药物的代谢和毒性。P-gp的这种功能对于确保药物的安全性至关重要，因为某些药物在P-gp功能受损的个体中可能引发严重的不良反应。尽管美国和欧洲的监管机构已发布指南，要求药物制造商评估新开发的人用药物是否为P-gp底物，但这些指南并未涵盖猫用药物。然而，猫群体中存在一种P-gp缺失突变（ABCB11930_1931del TC），该突变可能使部分猫对某些药物产生不良反应，例如新开发的宏环内酯类药物伊普瑞美辛（eprinomectin）在某些猫中引发了神经系统中毒症状。尽管已有研究表明伊普瑞美辛可能是犬类和人类的P-gp底物，但其在猫中的底物状态尚未得到充分验证。此外，一些猫在使用阿米洛利（amlodipine）、卡普罗莫瑞林（capromorelin）和西沙必利（cisapride）后也出现了神经系统毒性反应，但这些药物的MDR1基因型尚不清楚。因此，明确猫用药物是否为P-gp底物对于保障猫的用药安全具有重要意义。

为了填补这一研究空白，研究人员采用了一种竞争性外排实验方法，并结合一种表达P-gp的猫细胞系，对十三种在猫中常用的临床重要药物进行了评估。通过这种方法，他们发现其中十种药物，包括伊普瑞美辛，确实为猫的P-gp底物，而另外三种药物则未被识别为P-gp底物。这些结果不仅有助于识别哪些药物可能对P-gp功能受损的猫造成风险，也为药物开发过程中对猫用药物的筛选提供了依据。此外，这些数据还可能帮助优化剂量，降低对P-gp功能受损个体的潜在毒性风险。

在实验过程中，研究人员首先通过Western blot技术验证了CRFK细胞（猫肾皮质上皮细胞系）中P-gp和多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达情况。结果显示，CRFK细胞中P-gp的表达水平较高，而MRP1的表达则较弱。为了进一步确认P-gp的功能，他们使用了荧光探针罗丹明123（rhodamine 123）进行竞争性外排实验。实验中，CRFK细胞和人类P-gp表达细胞系hMDR1 MDCK细胞均表现出高效的罗丹明123外排能力，说明CRFK细胞确实能够模拟P-gp的功能。而当罗丹明123与已知的P-gp底物伊维菌素（ivermectin）共同孵育时，细胞内的罗丹明123浓度显著增加，这表明两种药物之间存在竞争性外排现象，进一步验证了P-gp的功能。

随后，研究人员对其他药物进行了竞争性外排实验，使用了两种不同的荧光探针——罗丹明123（R位点探针）和钙黄绿素AM（calcein AM，P位点探针）。实验结果表明，某些药物在与这些探针共同孵育时，会显著增加细胞内的荧光强度，从而被判定为P-gp底物。例如，环孢素A（cyclosporine A）、伊普瑞美辛、西沙必利、静脉注射的长春碱类药物（vinblastine和vincristine）以及选择性血清素再摄取抑制剂（selamectin）均表现出较强的P-gp底物特性。而其他药物，如阿米洛利、卡普罗莫瑞林、头孢维星（cefovecin）、多西环素（doxycycline）、甲泼尼龙（methylprednisolone）和隆替azole（ronidazole）则未表现出明显的竞争性外排，因此被认为不是P-gp底物。

值得注意的是，钙黄绿素AM不仅是一种P-gp底物，还可能被MRP1转运。因此，研究人员进一步通过竞争性外排实验评估了那些与钙黄绿素AM发生竞争的药物是否为MRP1底物。他们使用了另一种特异性荧光MRP1底物——羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）和MRP1特异性抑制剂MK-571进行检测。结果显示，甲泼尼龙和阿米洛利的MFI比值分别为1.1和1.0，表明它们不是MRP1底物，从而排除了MRP1在这些药物外排中的作用。这一发现进一步支持了实验结果的可靠性，即这些药物的外排主要由P-gp介导。

本研究的结论表明，CRFK细胞系能够有效地用于评估药物是否为猫的P-gp底物，这对于猫的药物安全具有重要价值。通过这一方法，研究人员成功地识别了多种药物的P-gp底物状态，包括伊普瑞美辛、环孢素A、西沙必利等，这些药物在P-gp功能受损的猫中可能引发严重的不良反应。此外，研究还指出，不同物种之间在P-gp底物状态上存在差异，因此不能简单地将人类或犬类药物的P-gp底物状态直接应用于猫。这意味着在开发和使用猫用药物时，必须基于猫自身的P-gp特性进行评估，以确保药物的安全性和有效性。

本研究的意义在于，它为猫的药物安全提供了新的工具和方法。通过建立一种可靠的体外筛选系统，研究人员能够快速、高效地确定哪些药物可能对P-gp功能受损的猫产生毒性。这种技术不仅可以用于评估现有的猫用药物，还可以在药物开发的早期阶段，对候选药物进行筛选，从而避免潜在的不良反应。此外，研究还强调了在猫的药物使用过程中，需要考虑到P-gp功能是否正常，特别是对于那些具有潜在毒性的药物，应根据其底物状态调整剂量或避免使用，以降低对P-gp功能受损猫的风险。

研究还指出了一些局限性。例如，实验中使用的培养基含有10%胎牛血清，这可能影响某些药物的外排行为。然而，由于MFI比值的计算方式将血清的影响纳入了分子和分母中，因此这种影响被部分抵消。此外，罗丹明123在其他物种中可能被OCT1和OCT2转运，这可能会对实验结果产生一定干扰。但研究人员指出，OCT1和OCT2的双向转运特性以及P-gp外排能力的显著优势，使得这种干扰的影响相对较小。此外，实验设计中采用的比值计算方法，也确保了不同转运蛋白的贡献被同时考虑，从而降低了误判的可能性。

综上所述，这项研究为猫的药物安全提供了重要的依据，并强调了P-gp在药物体内分布中的关键作用。通过体外实验，研究人员不仅确认了CRFK细胞系作为评估猫P-gp底物状态的有效工具，还识别了多种药物的底物特性，为临床用药提供了新的参考。未来，这种筛选方法有望被广泛应用于猫用药物的开发和使用过程中，以确保药物的安全性和有效性，特别是在P-gp功能受损的猫群中。此外，研究还提醒临床医生和研究人员，在使用药物时应充分考虑猫的P-gp状态，避免因药物相互作用而导致的不良反应。这不仅有助于提高猫的用药安全性，也有助于推动更加精准的兽药开发和应用。