将肝素硫酸盐类似物整合到胶原支架中以促进皮肤伤口愈合的潜力

《Wound Repair and Regeneration》：Potential of Heparan Sulphate Mimetics Integrated Into Collagen Scaffolds for Enhanced Skin Wound Healing

　　伤口愈合过程中，胶原蛋白支架结合RGTA OTR4120和 sonic hedgehog（SHH）可减少疤痕形成，促进血管生成和表皮修复，并通过调控巨噬细胞极化（M1向M2转化）抑制炎症反应。

　　本研究探讨了如何利用新型的生物材料促进全层皮肤伤口的愈合，并减少疤痕形成。皮肤损伤，尤其是深度较大的烧伤等，往往会导致显著的瘢痕，影响患者的正常生活和功能。当前，皮肤替代物在烧伤治疗中发挥重要作用，但其在减少瘢痕方面的效果仍存在局限。因此，研究人员开发了一种含有共价结合的ReGeneraTing Agent (RGTA) OTR4120（简称OTR）的I型胶原蛋白支架，旨在通过改善组织修复过程，提高急性伤口的愈合效率。为了进一步刺激皮肤再生，研究人员还将声音刺猬蛋白（Sonic Hedgehog, SHH）引入这些支架中，因为SHH在胚胎发育过程中对于组织形成、毛囊发育、细胞命运和表皮模式的调控具有关键作用。通过生物化学和组织学方法确认了OTR和SHH在支架中的存在，并进一步评估了它们在体外和体内对伤口愈合的影响。

### 1. 研究背景与意义

全层皮肤伤口通常会导致表皮和真皮的完整性受损，甚至影响皮肤附属结构，如毛囊和皮脂腺。这种类型的伤口不仅需要快速修复，还必须避免瘢痕形成，以防止皮肤收缩和功能受限。传统治疗方法如分层皮肤移植虽然有效，但其过程会带来额外的创面，并可能导致修复不完全，从而引发纤维化组织的形成。因此，研究者希望通过构建具有功能化的生物支架，如胶原蛋白支架，来提供更稳定的结构支持，并促进更自然的皮肤再生。

胶原蛋白支架作为一种常见的生物材料，具有良好的生物相容性和结构支持能力，常用于真皮修复。然而，其在体内环境中容易被降解，影响其长期效果。为了克服这一问题，研究人员开发了一种基于硫酸肝素的模拟物OTR4120，该分子具有抵抗多种降解酶（如肝素酶、软骨素酶、透明质酸酶和葡聚糖酶）的能力，因此能够更长时间地保留在支架中。此外，SHH作为一种重要的信号分子，在胚胎发育过程中对于组织形成和细胞分化具有重要影响。在动物模型中，SHH的表达水平与再生能力相关，而瘢痕形成则与SHH水平降低有关。因此，将SHH引入支架中，可能会对伤口愈合过程产生积极影响。

### 2. 材料与方法

研究中使用的支架为多孔结构的I型胶原蛋白支架（Col I），通过将0.8%（w/v）的胶原纤维素悬浮在0.25 M乙酸中，经过过夜浸泡和持续搅拌后形成。为了制备含有OTR4120的支架（Col I?+?OTR），研究人员在胶原蛋白悬浮液中加入了0.025%的OTR4120。这些支架随后通过化学交联（使用EDC和NHS）进行固化，并经过清洗和冻干处理。最后，通过伽马射线进行灭菌，确保支架在使用前达到无菌状态。

为了评估支架的性能，研究者使用了多种方法，包括扫描电子显微镜（SEM）观察支架的孔隙结构，以及通过TNBS法检测交联程度。此外，还通过点印迹法（dot blot）检测OTR4120在支架中的结合量。支架中的SHH含量则通过Western blot进行定量分析，并结合间接荧光显微镜观察其在支架中的分布情况。

在体外实验中，研究人员将M0巨噬细胞（未极化的巨噬细胞）种植在含有或不含OTR的支架上，并通过流式细胞术检测巨噬细胞的表型变化。同时，还通过ELISA检测培养液中的细胞因子浓度，以评估支架对炎症反应和免疫调节的影响。在体内实验中，使用了大鼠模型，将支架植入全层皮肤伤口中，并通过宏观和微观方法评估愈合过程，包括伤口收缩率、组织形态和皮肤结构的变化。

### 3. 实验结果

体外实验结果显示，含有OTR和SHH的支架能够显著影响巨噬细胞的极化状态。与未极化的M0巨噬细胞相比，这些支架上的巨噬细胞表现出较低的M1型标志物（如CD80、HLA-DR和PD-L1）表达，同时IL-10的产生显著增加。IL-10主要由M2c型巨噬细胞分泌，具有抗炎作用，并能抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，从而减少纤维化和瘢痕形成。

在体内实验中，经过28天的观察，含有OTR的支架表现出更优的愈合效果。具体而言，含有OTR的支架在第14天时显示出更少的伤口收缩（仅收缩24%和26%），而未治疗组的伤口收缩率高达78%。此外，支架处理后的伤口形态更接近圆形，这表明愈合过程更加均匀，减少了瘢痕形成的可能性。组织学分析显示，支架处理后的伤口中，毛细血管形成更多，同时残留的支架材料较少，表明支架在体内被有效降解，且不会阻碍组织再生。

在皮肤附属结构方面，含有OTR的支架促进了皮脂腺的形成，而对毛囊数量没有显著影响。这可能是因为OTR能够与一些生长因子（如WNT、SHH、BMP和FGF）结合，从而在局部环境中发挥调控作用，促进皮肤附属结构的重建。这些生长因子在皮肤发育和再生过程中起着关键作用，因此它们的持续释放可能对皮肤修复有积极影响。

### 4. 讨论与分析

研究结果表明，OTR4120的引入能够有效改善胶原蛋白支架的性能，使其在体内更稳定，并且能够结合SHH，从而促进更健康的愈合过程。体外实验显示，含有OTR的支架能够诱导巨噬细胞向M2型极化，减少炎症反应，同时促进抗炎因子IL-10的分泌。这种效应可能与OTR的抗炎特性有关，也可能与其对SHH的调控作用有关。SHH在支架中的分布情况显示，它在含有OTR的支架中能够更深入地渗透，而未含OTR的支架则主要集中在边缘。这种分布差异可能影响其在不同部位的信号传导，从而改变愈合过程的局部微环境。

在体内实验中，支架的使用不仅减少了伤口的收缩率，还改善了伤口的形态，使其更接近原始伤口的形状。这可能是因为支架能够提供更稳定的结构支持，同时促进细胞的均匀分布和组织的有序再生。此外，含有OTR的支架还促进了毛细血管的形成，为新生组织提供更多的营养支持，这可能有助于伤口的快速修复。

尽管研究取得了积极的进展，但仍有局限性。例如，研究未评估OTR4120与SHH的联合使用在体内的效果，也未对其他相关细胞（如真皮乳头细胞、神经细胞和表皮细胞）进行更全面的评估。此外，由于大鼠具有快速收缩的皮肤结构（如panniculus carnosus层），其愈合过程与人类存在差异，因此未来研究可能需要在更接近人类的模型（如猪）中进行验证。

### 5. 研究结论

综上所述，本研究成功构建了一种化学交联的多孔胶原蛋白支架，其中共价结合了OTR4120。这种支架在伽马灭菌后仍保持稳定，并能够有效结合SHH。体外实验表明，含有OTR的支架能够诱导巨噬细胞向M2型极化，减少炎症反应，同时促进抗炎因子IL-10的产生。体内实验进一步证实了OTR支架在改善伤口愈合中的潜力，表现出更少的瘢痕形成、更均匀的组织再生和更稳定的伤口形态。因此，OTR4120可能成为一种有前景的添加剂，用于改善细胞外基质（ECM）替代物在急性伤口修复中的效果。

本研究为未来开发更有效的皮肤修复材料提供了理论依据和实验支持，同时也揭示了OTR4120和SHH在调控伤口愈合过程中的潜在作用。通过结合这些分子，研究人员能够设计出更符合人体生理环境的生物支架，从而提高皮肤修复的质量和效率。未来的研究可以进一步探索这些分子在更广泛细胞类型中的作用，以及在不同动物模型中的适用性，以更好地模拟人类皮肤修复过程。