NMCR-6：一种新型的、非移动性的大肠杆菌素抗性基因在弧菌属细菌中的发现——全面特征分析及全球视角

《Decoding Infection and Transmission》：NMCR-6, a novel nonmobile colistin resistance gene in Vibrio bacteria: full characterization and global perspective

　　多粘菌素耐药基因NMCR-6的发现、进化分析及其全球流行病学特征。通过对高水平多粘菌素B耐药的V. harveyi WHSS0915菌株的基因组测序，鉴定出新型非移动多粘菌素耐药蛋白NMCR-6，并发现其存在13个亚型，广泛分布于55种Vibrio物种中，尤其是V. parahaemolyticus和V. vulnificus。全球地理分析显示，沿海国家如中国、美国、秘鲁和加拿大检出率最高，且NMCR-6.2亚型占比达50%。气候变暖导致海表温度上升，与NMCR-6检出率显著正相关，呈现从低纬向高纬扩散的趋势。该研究揭示了Aquaculture环境中NMCR-6的潜在传播风险，强调了整合"一个健康"策略控制耐药基因扩散的必要性。

　　在当前全球抗生素耐药性问题日益严峻的背景下，研究抗菌药物耐药性的来源、传播机制及潜在影响显得尤为重要。本文围绕一种名为NMCR-6的非移动性多粘菌素耐药基因展开，该基因由一种多粘菌素B高度耐药的哈维氏弧菌（*Vibrio harveyi*）菌株WHSS0915所携带，并通过一系列分析揭示了其在弧菌属中的广泛分布及其对公共卫生安全的潜在威胁。多粘菌素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后防线之一，然而其耐药性的快速扩散已成为全球医疗系统面临的重要挑战。因此，识别和预测新的非移动性多粘菌素耐药基因的出现，对于维持其临床疗效、防止耐药危机的爆发具有重要意义。

### 弧菌属的广泛分布与耐药性问题

弧菌属（*Vibrio*）是一类广泛存在于多种水生环境中的细菌，包括淡水、河口和海洋生态系统。这些细菌不仅对全球水产养殖业构成重大影响，还通过受污染的水体、食物和伤口暴露等途径，引发人类和陆地动物的多种感染。在超过100种已知的弧菌中，约有12种对人类具有致病性，可导致耳鼻喉感染、眼部感染、胃肠道感染、皮肤感染等临床症状。随着气候变化和极端天气事件的增加，沿海咸水区域正逐渐成为临床意义重大的弧菌病原体滋生的温床，例如副溶血性弧菌（*V. parahaemolyticus*）、创伤弧菌（*V. vulnificus*）和非致泻性霍乱弧菌（*V. cholerae*）。这一趋势使得更多人群面临严重的感染风险。

自1982年以来，适合弧菌传播的海岸线每年增加了约329公里，而到2022年，受弧菌感染威胁的地区已覆盖81个国家和地区，影响了超过14亿人口，并导致了约609,900例感染病例。在美国东海岸，从1988年到2018年，创伤弧菌感染病例增加了八倍，且感染范围每年扩大约48公里。这些数据凸显了弧菌感染在全球范围内的迅速扩散趋势，也反映出环境变化在其中扮演的关键角色。

### 多粘菌素耐药性的复杂性

多粘菌素（Polymyxins）作为最后的抗菌药物之一，其耐药性的出现对全球公共卫生构成了巨大威胁。近年来，随着农业中多粘菌素的广泛使用，其耐药性在革兰氏阴性菌中的传播显著增加，尤其是在水生环境中。然而，多粘菌素的耐药性不仅限于农业和环境因素，还与某些细菌的基因组特征密切相关。例如，非移动性多粘菌素耐药基因（NMCR）已被发现存在于某些细菌的染色体中，而非质粒中。这些基因的天然存在可能为多粘菌素耐药性的传播提供新的途径。

在本研究中，研究人员发现了一种具有显著多粘菌素B耐药性的哈维氏弧菌菌株WHSS0915，其最小抑菌浓度（MIC）超过512 μg/mL。通过基因组测序和功能分析，该菌株被鉴定出携带一种染色体编码的耐药蛋白，即NMCR-6。这一发现不仅揭示了弧菌中存在非移动性多粘菌素耐药基因，还进一步明确了该基因在多种弧菌物种中的分布情况。通过对22,787个可用的弧菌基因组进行分析，研究人员识别出14,158个与NMCR-6高度同源的蛋白质序列，并根据这些序列的首次发表年份将其划分为13个亚型（NMCR-6.1至NMCR-6.13）。这一分类有助于更系统地理解NMCR-6的多样性及其在不同环境中的传播模式。

### NMCR-6的进化与传播机制

在进化层面，NMCR-6与已知的移动性多粘菌素耐药基因（MCR）和非移动性多粘菌素耐药基因（NMCR）之间存在一定的亲缘关系。通过构建最大似然树（Maximum Likelihood Tree, ML Tree）并进行系统发育分析，研究人员发现NMCR-6形成了一个独特的分支，介于MCR-1/MCR-4/NMCR-1/NMCR-2/NMCR-5与MCR-3/MCR-7/MCR-9/MCR-10/NMCR-3/NMCR-4之间。这一发现表明，NMCR-6可能经历了独立的进化路径，与其他MCR/NMCR蛋白相比，具有一定的独特性。

此外，NMCR-6的分布模式也受到多种环境因素的影响。研究人员发现，沿海国家，尤其是那些拥有发达水产养殖业和海鲜贸易的地区，是NMCR-6的主要传播区域。其中，中国、美国、秘鲁和加拿大报告的检测率较高，而欧洲、非洲和大洋洲的检测率相对较低。这可能与这些地区的气候条件、水体环境以及农业和水产养殖业的使用情况有关。值得注意的是，NMCR-6的检测率与海水温度的变化存在显著相关性，尤其是在厄尔尼诺现象（El Ni?o）期间，如1997-1998年和2015-2016年的厄尔尼诺事件，NMCR-6的检测率出现了明显上升。这表明，全球范围内的弧菌爆发可能与气候变化密切相关，特别是海水温度的升高可能促进了NMCR-6的传播。

### 环境与公共卫生的双重挑战

NMCR-6的广泛分布不仅影响了环境中的弧菌种群，也对公共卫生构成了潜在威胁。由于NMCR-6主要存在于染色体中，其传播方式不同于传统的质粒介导型耐药基因。然而，这一特性也使得NMCR-6在不同物种间的传播更加复杂，尤其是在水生环境与陆地生态系统之间的相互作用。例如，某些弧菌物种可能通过基因水平转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）将NMCR-6基因传递给其他细菌，从而形成新的耐药性菌株。

这一现象在非霍乱弧菌（如副溶血性弧菌和创伤弧菌）中尤为明显。这些菌株不仅是人类感染的重要病原体，还在水生生态系统中扮演着关键角色。因此，NMCR-6的传播不仅影响了水生环境的微生物生态，还可能通过食物链影响人类健康。例如，NMCR-6的检测率在临床样本中较高，尤其是在副溶血性弧菌和创伤弧菌中。这表明，NMCR-6可能已成为这些病原体耐药性形成的重要因素之一。

### 研究方法与技术手段

为了深入研究NMCR-6的结构、功能及传播模式，研究人员采用了多种先进的技术手段。首先，通过全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）对WHSS0915菌株进行了详细的基因组分析，以确定其耐药性相关基因的组成。随后，利用BLASTP工具对整个弧菌属的蛋白质数据库进行了搜索，识别出具有高度同源性的序列，并进一步进行了聚类分析和系统发育研究。

在系统发育分析中，研究人员利用CD-HIT工具对同源序列进行了聚类，并根据遗传距离计算了不同亚型之间的亲缘关系。通过这种方法，他们成功地将NMCR-6划分为13个亚型，并利用R语言进行进一步的数据分析和可视化。此外，为了探索NMCR-6的结构特征，研究人员还使用了TMHMM 2.0工具预测其跨膜结构，并通过ESPript 3.0对不同亚型的二级结构进行了比较分析。这些分析不仅揭示了NMCR-6的结构特征，还进一步验证了其与其他MCR/NMCR蛋白之间的进化关系。

在功能验证方面，研究人员通过将NMCR-6基因克隆到pET-28a载体中，并在大肠杆菌（*E. coli*）BL21中进行异源表达，评估了该蛋白对多粘菌素B的耐药性。实验结果表明，异源表达的NMCR-6能够显著增强大肠杆菌对多粘菌素B的耐受能力，其最小抑菌浓度（MIC）可达到64 μg/mL，远高于欧盟抗菌药物敏感性测试委员会（EUCAST）的临界值（2 μg/mL）。这一结果不仅证明了NMCR-6在多粘菌素耐药性中的关键作用，也为后续研究提供了重要的实验依据。

### 全球分布与传播趋势

从全球分布的角度来看，NMCR-6在不同地区和不同弧菌种类中的存在具有显著的地理差异。研究人员发现，亚洲和北美洲是NMCR-6的主要分布区域，其中NMCR-6.2是最常见的亚型。相比之下，欧洲、非洲和大洋洲的检测率较低，这可能与这些地区的水产养殖业规模、海水温度以及抗菌药物使用情况有关。此外，研究还发现，NMCR-6的分布与纬度和温度变化密切相关，尤其是在低纬度地区，其检测率较高。然而，这一趋势并不完全适用于所有NMCR-6亚型，例如NMCR-6.2在低纬度地区和高纬度地区的分布可能存在一定的重叠。

值得注意的是，NMCR-6的检测率在某些特定年份出现了显著上升，如厄尔尼诺事件期间。这一现象可能与海水温度的升高以及相应的弧菌种群动态有关。此外，研究还发现，NMCR-6的传播可能受到多种因素的影响，包括农业和水产养殖业中多粘菌素的使用、水体污染程度以及不同宿主之间的基因水平转移。这些因素共同作用，使得NMCR-6在不同环境中广泛存在，并可能通过多种途径传播到其他细菌种群中。

### 公共卫生与生态系统的联系

从公共卫生角度来看，NMCR-6的广泛分布可能对现有的抗菌药物治疗策略构成挑战。由于多粘菌素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的重要药物，其耐药性的增加将直接导致治疗选择的减少，甚至可能引发新的耐药危机。因此，对NMCR-6的深入研究不仅有助于理解其在弧菌中的传播机制，还能为未来抗菌药物的合理使用和耐药性监测提供科学依据。

此外，研究还强调了“One Health”（一个健康）理念的重要性。该理念主张将人类、动物和环境健康视为一个整体，以更全面地应对抗菌药物耐药性问题。由于NMCR-6可能在水生环境中广泛存在，并通过食物链影响人类健康，因此需要加强跨学科合作，结合环境监测、动物健康管理和人类疾病防控，共同应对这一全球性挑战。

### 研究的局限性与未来方向

尽管本研究在NMCR-6的发现和分析方面取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，研究主要基于中国、美国、秘鲁和加拿大等地区的数据，而欧洲、非洲和大洋洲的样本数量相对较少，这可能影响研究结果的普遍适用性。其次，由于数据获取的限制，研究人员未能覆盖所有可能的弧菌基因组，导致部分NMCR-6亚型的遗漏。此外，NMCR-6的传播机制尚不完全明确，特别是在不同物种之间的基因转移路径方面仍需进一步研究。

未来的研究方向应包括以下几个方面：一是扩大样本来源，尤其是在数据较少的地区，以更全面地评估NMCR-6的全球分布情况；二是进一步探索NMCR-6在不同环境中的传播机制，包括其是否能够通过质粒或其他移动遗传元件（如转座子、噬菌体等）进行水平转移；三是加强对多粘菌素耐药性的监测，尤其是在农业和水产养殖业中，以评估其对环境和人类健康的潜在影响。此外，还需要开发新的检测方法和防控策略，以应对NMCR-6可能带来的公共卫生挑战。

### 结论与意义

综上所述，本研究揭示了NMCR-6在弧菌属中的广泛分布及其对多粘菌素耐药性的贡献。通过基因组测序、系统发育分析和环境数据整合，研究人员不仅明确了NMCR-6的结构和功能，还揭示了其在不同地区和不同宿主中的传播模式。这些发现为理解多粘菌素耐药性的起源和传播提供了新的视角，并强调了环境因素在抗菌药物耐药性形成中的重要作用。

更重要的是，本研究为未来的抗菌药物管理和耐药性监测提供了重要的科学依据。随着全球气候变化和人类活动对水生生态系统的影响日益加剧，NMCR-6的传播可能进一步加剧多粘菌素耐药性的扩散。因此，加强国际合作，推动跨学科研究，制定有效的防控措施，是应对这一挑战的关键。同时，还需加强对农业和水产养殖业中抗菌药物使用的监管，以减少其对环境和人类健康的潜在威胁。只有通过综合手段，才能有效遏制多粘菌素耐药性的进一步发展，保障其作为最后防线的临床价值。