CmVNI2-CmMYB3模块调控低温诱导菊花黄酮醇生物合成的分子机制

　　为解决低温抑制药用菊花活性成分黄酮醇积累的机制问题，研究人员开展NAC转录因子CmVNI2调控黄酮醇生物合成的主题研究。发现CmVNI2通过直接激活CmF3H和CmMYB3表达正调控黄酮醇合成，低温通过抑制该模块减少黄酮醇积累。该研究首次揭示NAC-MYB调控网络在菊花低温响应中的核心作用，为改良药用植物活性成分提供新靶点。

　　

深秋时节，菊花傲霜绽放，不仅展现惊人的抗寒能力，其花朵更是传统中药和花茶的重要原料。菊花中的黄酮醇类化合物作为主要生物活性成分，具有显著的抗氧化和保健功能。然而令人困惑的是，低温环境虽然能增强许多植物营养器官中类黄酮的积累，却会显著降低菊花花朵中黄酮醇的含量。这种生殖器官与营养器官对低温的相反响应模式，其背后的分子调控机制长期以来是个未解之谜。

发表在《Molecular Horticulture》的研究论文首次揭示了NAC转录因子CmVNI2通过直接调控黄酮醇生物合成关键基因CmF3H和调控因子CmMYB3，在菊花响应低温胁迫中发挥核心作用。该研究不仅阐明了低温抑制黄酮醇积累的分子机制，更为改良药用植物活性成分提供了重要的理论依据和基因靶点。

研究人员综合运用多组学分析、基因功能验证和分子互作研究等技术手段，其中关键实验包括：基于菊花数据库（http://210.22.121.250:8880/asteraceae/homePage）的基因序列获取、RNA干扰（RNAi）和过表达（OE）遗传转化、DNA亲和纯化测序（DAP-seq）全基因组结合位点分析、酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白-DNA互作、双荧光素酶（dual-LUC）报告系统检测转录激活活性，以及超高效液相色谱-电喷雾-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）靶向代谢组学分析。实验材料主要使用菊花（Chrysanthemum morifolium）栽培种和野菊花（C. indicum）。

黄酮醇积累与CmVNI2表达在低温下同步降低

研究发现菊花头状花序中，舌状花（ray florets）和管状花（disc florets）存在明显的代谢物分布差异。靶向代谢分析显示槲皮素（quercetin）及其衍生物主要积累在管状花中（图1b），与黄酮醇生物合成基因CmFLS和CmF3H在管状花中的高表达模式一致（图1c,d）。通过共表达网络分析，研究人员从10个花器官样本的RNA测序数据中筛选出与黄酮醇合成基因高度相关的转录因子，最终锁定NAC家族成员CmVNI2作为候选调控因子（图1e）。

CmVNI2编码一个包含255个氨基酸的蛋白，其N端含有典型的NAC结构域，包含5个保守氨基酸基序（图S1）。系统进化分析表明CmVNI2与拟南芥AtVNI2亲缘关系最近，同属于参与生长和次级细胞壁（SCW）发育的NAC蛋白亚群（图S2）。表达模式分析显示CmVNI2在管状花中特异性高表达（图1f,g），且在7天低温（10°C）处理后表达显著下调（图1h）。与此对应，黄酮醇成分（槲皮素和山奈酚）含量明显减少，而黄酮成分（芹菜素和木犀草素）却显著增加（图1i,j），表明低温特异性地抑制了黄酮醇生物合成途径。

CmVNI2正调控菊花黄酮醇生物合成

通过RNA干扰技术敲低CmVNI2表达后，转基因植株株高显著降低而花径无显著变化（图2a-d）。靶向代谢组学分析发现CmVNI2 RNAi株系中55-56个黄酮代谢物发生显著变化，其中黄酮醇、黄烷酮和黄酮苷类含量显著降低，而黄酮苷元（aglycones）总量显著增加（图2e-i）。主成分分析清晰区分野生型（WT）和RNAi株系的代谢谱（图S3a），表明CmVNI2缺失引起黄酮代谢全局重编程。

低温处理实验进一步揭示：在正常条件下，WT植株中黄酮醇和黄烷酮含量显著高于CmVNI2 RNAi株系；经7天低温处理后，WT植株中这些成分降至与RNAi株系相当水平（图3a-e）。相反，CmVNI2过表达株系在常温和低温下均表现出黄酮醇和黄烷酮含量升高，而黄酮含量降低（图3f-j）。这些结果证明CmVNI2是低温响应性黄酮代谢重编程的关键调控因子。

CmVNI2 knockdown影响黄酮醇生物合成相关基因表达

转录组分析发现CmVNI2 RNAi株系中有1,606个差异表达基因（DEGs），其中782个上调、824个下调（图4a）。KEGG富集分析显示这些基因主要参与“淀粉和蔗糖代谢”、“苯丙烷生物合成”和“细胞衰老”通路（图4b）。GO分析表明下调基因显著富集在“细胞壁”、“花粉发育”和“黄酮生物合成过程”等条目（图S4）。

功能注释发现9个下调的黄酮生物合成相关基因，包括2个CmCHS、2个CmCHI、3个CmF3H、1个CmDFR和1个黄酮醇特异性MYB转录因子CmMYB3（图4c）。值得注意的是，木质素生物合成基因CmHCT和CmCAD也受调控，提示CmVNI2可能协调苯丙烷代谢流向黄酮和木质素分支的分配。qRT-PCR验证了RNA-seq结果，证实CmCHS、CmCHI、CmF3H和CmMYB3在RNAi株系中表达显著降低（图4d）。

全基因组范围内鉴定CmVNI2结合位点

DAP-seq分析在两个生物学重复中鉴定到33,903个富集峰，对应3,709个基因（图5a）。这些结合位点长度在239-3,152 bp之间，主要分布在转录起始位点（TSS）附近（图5b）。基因组特征分布显示结合位点位于外显子（3.04%）、内含子（3.96%）、基因间区（88.74%）和启动子区（4.26%）（图5c）。

通过HOMER进行de novo motif预测发现NAC motifs（包括ANAC083、VND4和ANAC057）显著富集（图5d）。GO富集分析显示CmVNI2结合基因显著参与“激素代谢过程”、“细胞分裂”、“色素代谢过程”、“花粉萌发”和“细胞壁结构组成”等生物学过程（图5e），表明CmVNI2通过直接靶向这些基因参与细胞壁结构和代谢生物合成的多种生物学途径。

鉴定直接靶基因

整合DAP-seq和RNA-seq数据发现118个共同基因（图6a）。KEGG富集显示这些直接靶基因参与“类固醇激素生物合成”、“视黄醇代谢”、“氧化磷酸化”和“黄酮生物合成”等通路（图6b）。其中CmCHS和CmF3H被鉴定为CmVNI2直接靶基因（图6c），而木质素生物合成基因CmHCT和CmCAD也受直接调控（图6d），表明CmVNI2通过直接靶向这些结构基因协调苯丙烷代谢流向。

CmVNI2直接调控黄酮醇生物合成途径关键基因

虽然RNA-seq显示CmMYB3在CmVNI2 RNAi株系中显著下调，但其基因座未出现在DAP-seq峰中。深入分析发现DAP-seq数据中CmMYB3启动子区域读段富集倍数分别为1.974和2.379（图7a），表明CmVNI2直接调控CmMYB3表达。实验鉴定到两个SG19 MYB蛋白（CmMYB24_1和CmMYB24_2），其中CmMYB24_1被证实为CmVNI2靶标（图S6）。

Y1H实验显示CmVNI2与CmF3H和CmMYB3启动子结合，而不与CmCHS、CmCHI和CmMYB24_1启动子结合（图7b；图S7）。EMSA和dual-LUC实验进一步证实CmVNI2直接结合并激活CmF3H和CmMYB3启动子（图7c,d）。表达分析显示低温处理后CmCHS、CmCHI、CmF3H和CmMYB3表达均下调（图7e,f），证明CmVNI2通过直接调控这些基因响应低温胁迫。

CmMYB3过表达恢复CmVNI2沉默导致的黄酮醇积累减少

为验证CmVNI2是否通过调控CmMYB3影响黄酮醇积累，研究者在CmVNI2 RNAi植株中瞬时过表达CmMYB3。代谢分析显示，与WT和CmVNI2 RNAi植株相比，CmMYB3+CmVNI2 RNAi植株中黄酮醇（芦丁和槲皮素-7-葡萄糖苷）和黄烷酮（圣草枸橼苷和橙皮素）积累显著恢复（图8a）。qRT-PCR显示CmMYB3及结构基因CmCHS、CmCHI、CmF3H和CmFLS表达显著上调（图8b），证实CmMYB3参与CmVNI2介导的黄酮醇生物合成转录调控。

研究结论与意义

该研究系统阐明了CmVNI2-CmMYB3模块在菊花响应低温胁迫调控黄酮醇生物合成中的核心作用。CmVNI通过直接激活CmF3H和CmMYB3表达，正向调控黄酮醇积累；低温通过抑制该模块的表达，导致黄酮醇含量下降同时黄酮苷元积累增加。

这一发现具有多重重要意义：首先，首次在菊花中揭示了NAC转录因子调控黄酮代谢的分子机制，拓展了对植物次生代谢调控网络的认识；其次，发现低温通过特异性抑制CmVNI2-CmMYB3模块重编程苯丙烷代谢流向，为理解环境因子调控植物代谢提供新视角；第三，鉴定到CmVNI2直接靶基因包括黄酮和木质素生物合成关键酶基因，表明该转录因子在协调碳流向不同苯丙烷分支中起枢纽作用；最后，该研究为通过遗传改良提高药用菊花活性成分含量提供了关键靶基因，具有重要的应用价值。

该研究不仅为解决低温降低药用植物品质的产业难题提供了理论依据，也为其他经济作物的代谢改良提供了可借鉴的分子模块。