新型阳离子肽RTP004联合PS20替代人血清白蛋白稳定A型肉毒毒素制剂的机制与应用研究

　　本刊推荐：为解决HSA作为稳定剂存在的潜在安全风险与BoNTA制剂稳定性问题，研究人员开展新型合成阳离子肽RTP004联合PS20的稳定化策略研究。结果表明，RTP004通过静电相互作用结合RTT150重链，显著增强其热稳定性（Tagg提升至56°C），并与PS20协同完全抑制表面吸附。该非HSA配方成功应用于DaxibotulinumtoxinA制剂，为生物制剂开发提供新范式。

　　

在生物制药领域，蛋白质药物的稳定性始终是制约其疗效与安全性的关键因素。特别是对于A型肉毒毒素（Botulinum toxin type A, BoNTA）这类高活性、低浓度的生物制剂，其在生产过程和储存期间极易发生表面吸附和结构变性，导致药物效价降低。更令人担忧的是，目前市售的BoNTA产品普遍采用人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）作为稳定剂，虽然其稳定效果得到公认，但潜藏的安全风险不容忽视：一方面，HSA来源于人血浆，存在病原体污染的理论风险；另一方面，HSA可能与治疗性蛋白形成聚集体，增加中和性抗药抗体产生的风险，不仅降低疗效，还可能影响内源性蛋白功能。

为此，Revance Therapeutics公司的科研团队开展了一项创新研究，开发出一种全新的稳定化策略——采用专利合成的阳离子肽RTP004联合非离子表面活性剂聚山梨酯20（Polysorbate 20, PS20）来替代HSA。这项研究成果发表在《International Journal of Pharmaceutics》上，为生物制剂的安全稳定提供了全新解决方案。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过酶联免疫吸附测定（ELISA）分析RTP004与150 kDa BoNTA核心神经毒素（RTT150）的相互作用机制；利用动态光散射（DLS）技术测定不同配方下RTT150的热稳定性参数（聚集起始温度T_agg和聚集速率）；采用天然聚丙烯微孔板和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETG）容器模拟生产工艺条件，评估表面吸附抑制效果；通过设计实验（DOE）和稳定性研究验证配方在规模化生产中的可靠性；使用AlphaLISA技术和小鼠半数致死剂量（LD₅₀）测定法分别定量毒素含量和生物活性。

研究结果方面：

3.1. RTP004与RTT150的静电相互作用

通过ELISA结合实验发现，RTP004以剂量依赖方式与RTT150特异性结合，半数有效浓度（EC50）为32 nM。特别值得注意的是，RTP004选择性抑制抗BoNTA重链单克隆抗体与RTT150的结合，而对轻链抗体结合无影响，表明其结合位点位于毒素重链区域。这种结合可能通过增强分子偶极取向，促进毒素与神经细胞膜的相互作用。

3.2. RTP004、PS20和HSA对RTT150热稳定性的影响

动态光散射分析显示，RTP004能显著提高RTT150的热稳定性，在≥38 μg/mL浓度下使聚集起始温度（T_agg）从53°C提升至56°C，并将聚集速率降低1.7倍。出乎意料的是，PS20单独使用反而降低T_agg至51°C，而HSA更表现出明显的 destabilizing effect（去稳定效应），使T_agg降至46°C。这种负面效应可能与HSA促进RTT150熔融结构形成有关。当RTP004与PS20或HSA联用时，能有效逆转这些不稳定效应，证明其核心稳定作用。

3.3. RTP004和PS20对微孔板中非特异性表面吸附的稳定作用

在模拟实际生产条件的吸附实验中，单独使用RTP004无法防止RTT150在聚丙烯材料表面的吸附，而PS20或HSA在低浓度下即可提供80%以上的回收率。关键在于，RTP004与0.05% PS20组合能实现100%的毒素回收，且这种保护效果在长期储存中保持稳定，显著优于传统HSA配方。

3.4. 药物产品生产过程中RTP004和PS20对非特异性表面吸附的稳定作用

在最能反映实际生产条件的PETG容器实验中，单独使用RTP004或PS20均不能完全防止毒素吸附（分别约80%和60%回收率），但二者组合却能实现24小时内100%回收。在模拟生产工艺的保持时间研究中，含RTP004/PS20的配方在16小时保持后仍能保持98%以上的毒素含量和活性，而仅含PS20的配方损失约36%的含量和相应活性。设计实验（DOE）研究进一步证实，只有RTP004和PS20组合能 consistently 实现目标毒素含量（0.23 ng/瓶）和效价（50 U/瓶）的完全回收。

研究结论与讨论部分强调，RTP004作为一种新型合成阳离子肽，通过静电相互作用与BoNTA重链结合，形成紧密的四级结构，显著增强毒素的热稳定性并减缓聚集速率。与PS20协同作用时，能完全抑制毒素在容器表面的吸附，解决低浓度生物制剂生产中的核心难题。这种非HSA稳定策略不仅避免了血浆来源 excipient 的潜在风险，还可能降低免疫原性风险，为生物制剂开发提供了新方向。DaxibotulinumtoxinA（DAXXIFY?）作为首个采用此技术的上市产品，其72小时的复溶后稳定性显著优于传统BoNTA产品的24小时，充分证明了该技术的临床应用价值。这项研究不仅为BoNTA制剂提供了创新解决方案，也为其他易吸附、不稳定的生物制剂开发提供了重要借鉴。