通过整合蛋白质组学和生物信息学技术，探索肾气养肾颗粒在慢性肾脏病-矿物质与骨代谢紊乱（CKD-MBD）中的药理机制

《Journal of Ethnopharmacology》：Exploring the pharmacological mechanism of Shenqi Yanshen Granule in chronic kidney disease-mineral and bone disorder (CKD-MBD) through integrated proteomics and bioinformatics

　　该研究通过整合蛋白质组学和生物信息学方法，探讨肾气丸（SYG）治疗慢性肾病-矿物质骨代谢紊乱（CKD-MBD）的机制。结果表明SYG通过下调MAPK通路中的PAK2和CRKL表达，抑制破骨细胞分化，改善患者肾功能（Scr、BUN）、骨代谢指标（Ca、iPTH、25(OH)VD等）及骨密度（BMD）。分子模拟证实伊卡里因（icariin）能稳定结合上述靶点，体外实验验证其抑制RANKL诱导的破骨细胞分化的作用。研究首次揭示SYG治疗CKD-MBD的多靶点机制，为中药现代化提供理论依据。

　　这项研究聚焦于中药制剂“参芪延肾颗粒”（SYG）在慢性肾脏病-矿物质和骨代谢紊乱（CKD-MBD）中的治疗机制。研究团队通过整合蛋白质组学和生物信息学方法，系统性地揭示了SYG在改善CKD-MBD中的潜在作用路径。SYG是一种源自知名中医专家张新正教授的经方，其主要成分包括七种中药材，如人参、牛膝、黄芪、淫羊藿、川芎、熟地黄和鳖甲。这种配方通过补肾、活血、祛毒、化瘀等作用机制，被广泛应用于CKD的临床治疗，包括CKD-MBD。

CKD-MBD是CKD最常见的并发症之一，尤其在3至5期更为显著。它通常在CKD早期阶段就可能出现，并且在儿童患者达到CKD 5期时几乎普遍存在。CKD-MBD涉及矿物质和骨代谢的全身性失调，表现为血清钙、磷、甲状旁腺激素（iPTH）、骨特异性碱性磷酸酶（b-ALP）以及维生素D代谢的异常，同时伴随着骨转换、矿化和体积（TMV）的障碍。这些生化和骨骼异常会导致一系列临床后果，包括骨骼生长受限、骨折风险增加以及骨骼外的钙化现象。尽管早期干预对改善CKD-MBD至关重要，但目前主要针对钙、磷和iPTH管理的治疗手段效果有限，未能有效降低CKD-MBD的高死亡率。

根据中医理论，CKD-MBD被视为一种以骨为中心的骨质病变，源于肾虚和体内瘀滞毒邪的积累。中医认为“肾主骨”，肾的功能包括储藏精气、维持骨骼的稳态以及生成骨髓。肾精的损伤可能导致骨骼脆弱、骨髓耗竭以及矿物质代谢紊乱。因此，中医治疗CKD-MBD通常采用补肾和强骨的策略，以恢复机体的平衡状态。随着对中医作为补充和替代疗法的认可度不断提升，SYG在这些患者中的应用也日益受到重视，显示出其在改善临床结局方面的潜力。

SYG的临床应用已显示出一定的疗效，包括改善肾功能、降低血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平，同时提高估算肾小球滤过率（eGFR）。此外，SYG还能减轻肾小管损伤标志物，如N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的表达。更重要的是，SYG能够促进成骨细胞的分化，并通过上调Wnt5a增强MC3T3-E1细胞的骨形成能力。这些结果表明，SYG在CKD-MBD的治疗中具有广阔的前景。

然而，SYG对矿物质和骨代谢的具体影响及其作用机制仍需进一步明确。为此，本研究采用了一种整合的方法，结合蛋白质组学和生物信息学技术，以全面揭示SYG的多靶点作用机制。研究过程中，首先对44名CKD-MBD患者进行了分组，其中23名患者接受标准治疗加SYG（每日两次，每次30克），21名患者仅接受标准治疗。此外，还设立了20名健康对照组（NG）以进行比较分析。经过8周的治疗后，研究团队对患者的肾功能、矿物质和骨代谢指标以及骨矿物质密度（BMD）进行了评估。

在蛋白质组学分析中，SYG被发现能够下调MAPK信号通路中的PAK2和CRKL蛋白表达。随后，通过网络药理学方法，研究团队识别出淫羊藿苷（icariin）作为SYG中的关键活性成分，其能够同时结合PAK2和CRKL。这一结论得到了分子对接和动态模拟实验的支持，表明icariin与这两个靶点结合后能够形成稳定的复合物。进一步的体外实验显示，SYG和icariin均能显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化过程中PAK2和CRKL的表达，包括其在mRNA和蛋白质水平上的变化。

这些发现表明，PAK2和CRKL可能是SYG在治疗CKD-MBD中的关键靶点，而icariin可能是其中的重要活性成分。SYG通过调控这些靶点，可能在改善矿物质和骨代谢紊乱方面发挥重要作用。同时，这些研究结果也表明，SYG可能是一种针对CKD-MBD肾和骨骼双重作用的多组分疗法，为中医治疗慢性肾脏病相关疾病提供了新的分子机制依据。

研究团队在实验过程中还对SYG的成分进行了质量控制。通过高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD），研究人员建立了SYG的特征色谱图，并鉴定了其中的13种化学成分，包括黄酮类化合物如芒柄黄素-7-葡萄糖苷，以及皂苷类成分如人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1，还有黄芪甲苷、淫羊藿苷等。这些成分的鉴定为SYG的定性分析提供了基础，并有助于确保其在临床应用中的质量和一致性。

此外，研究还强调了SYG在治疗CKD-MBD中的多靶点特性。不同于以往研究主要关注肾功能或单一药理效应，本研究采用了一种更为全面的整合方法，不仅评估了临床参数，还结合了蛋白质组学、网络药理学、分子对接、动态模拟以及体外功能实验，以系统性地识别SYG的重要作用靶点和活性成分。这种方法为揭示中药复方的复杂作用机制提供了新的思路，并有助于推动中医在现代医学中的应用。

研究团队还明确说明了本研究的伦理审查情况。研究方案已获得重庆中医药医院伦理委员会的批准（批准号2020-ky-22），并且在临床试验注册平台ChiCTR进行了注册（注册号ChiCTR2300075582）。注册日期为2023年9月8日，该研究为回顾性注册。这些信息表明研究的科学性和伦理合规性，同时也为未来的研究提供了可追溯的依据。

在研究过程中，团队成员各司其职，共同推动了研究的顺利进行。其中，王琴负责论文的撰写和审阅以及资金获取； Ran强负责论文的原始撰写和资金获取； Liu梅负责数据分析； Zhang小琼负责数据整理； Li Ying负责数据整理； Fan小红负责论文的撰写和审阅； Liu小负责数据可视化。这种分工合作的方式确保了研究的全面性和严谨性，同时也体现了团队在科研过程中的协作精神。

最后，研究团队声明不存在与本研究相关的竞争性利益关系。这一声明进一步强化了研究的可信度，表明研究结果的客观性和公正性。此外，研究还引用了多个相关文献，以支持其研究结论和方法的科学性。这些文献涵盖了CKD-MBD的流行病学、病理生理学、中医治疗策略以及SYG的成分和药理作用等方面，为本研究提供了坚实的理论基础。

综上所述，这项研究通过整合多种现代科学技术，系统性地揭示了SYG在治疗CKD-MBD中的作用机制。研究结果不仅为SYG的临床应用提供了新的科学依据，也为中医在现代医学中的发展提供了新的视角。同时，研究还强调了icariin作为SYG中的关键活性成分，可能在调节矿物质和骨代谢方面发挥重要作用。这些发现为进一步的临床试验和药物开发奠定了基础，具有重要的科学价值和临床意义。