从传统抗疟疾药物中提取的青蒿素-羟氯喹组合，通过PI3K/AKT/GSK3β途径抑制上皮-间充质转化，从而减轻肺纤维化

《Journal of Ethnopharmacology》：Artemisinin-hydroxychloroquine combination from traditional antimalarial medicine attenuates pulmonary fibrosis via PI3K/AKT/GSK3β-mediated inhibition of epithelial-mesenchymal transition

　　该研究通过体内（大鼠博莱霉素诱导肺纤维化模型）和体外（TGF-β1诱导A549细胞EMT模型）实验，系统验证了阿司匹林-羟氯喹（AH）组合抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路、逆转上皮间质转化（EMT）及减轻肺纤维化的机制，为IPF治疗提供了新策略。

　　这项研究聚焦于一种传统抗疟疾药物组合——青蒿素与羟氯喹（AH）在治疗特发性肺纤维化（IPF）方面的潜力。IPF是一种进展性、慢性肺部疾病，其病因不明，主要特征是异常的细胞外基质（ECM）沉积，导致肺组织硬化和不可逆的肺功能下降。由于IPF的高致死率和快速进展，目前迫切需要更安全、更有效的治疗方案。现有的抗纤维化药物如尼达尼布和吡非尼酮虽然能延缓疾病进程，但对整体生存率的影响有限，且伴随显著的副作用，如胃肠不适和肝酶升高，给患者带来沉重的经济负担。肺移植虽然能显著改善长期生存率，但受限于供体短缺、手术并发症和免疫排斥反应，难以广泛推广。

基于这一背景，研究团队选择了一种传统药物组合——青蒿素与羟氯喹，进行深入探讨。青蒿素是从黄花蒿（*Artemisia annua L.*）中提取的主要活性成分，而羟氯喹则是氯喹的羟基衍生物，其药理基础源于金鸡纳树（*Cinchona calisaya*）中提取的奎宁。这两类药物在历史上被广泛用于治疗疟疾和发热，但近年来研究发现，它们在抗炎、免疫调节和抗纤维化等方面也展现出广泛的药理作用。特别是青蒿素，其多靶点、多通路的特性使其在治疗IPF方面具有潜在价值。此外，羟氯喹作为免疫调节剂，在系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的治疗中发挥着重要作用，且能够抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的纤维化信号通路，从而改善实验性肾和肺纤维化。

研究团队认为，将青蒿素与羟氯喹结合使用，不仅可以利用其各自的药理特性，还能通过协同作用增强疗效，同时减少药物的毒性。已有初步数据表明，以1:1比例配伍的AH组合能够产生协同的抗纤维化效果，并有效降低羟氯喹相关的副作用。然而，AH组合在IPF治疗中的具体分子机制尚不明确，因此本研究通过体内和体外实验，系统地评估AH的抗纤维化效果，并探索其潜在的作用机制。

在实验设计方面，研究团队使用了多种方法来评估AH的疗效。首先，通过气管内注射博来霉素（BLM）诱导Sprague-Dawley大鼠模型，模拟IPF的病理过程。随后，从建模第7天开始，大鼠接受AH或尼达尼布的口服治疗。为了评估肺部结构和纤维化程度，研究团队采用了小动物能量谱CT成像、肺功能测试、苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色，以及肺组织羟脯氨酸（HYP）定量分析。这些方法能够全面反映肺部的病理变化和纤维化程度。

此外，研究团队还通过Western blot、免疫组化和转录组分析等技术，进一步探讨AH的作用机制。为了验证AH的抗纤维化效果，研究团队在A549细胞中建立了TGF-β1诱导的上皮-间质转化（EMT）模型。EMT是IPF发展中的关键机制，表现为肺泡上皮细胞在TGF-β1等刺激下转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，导致异常的ECM沉积。通过这一模型，研究团队能够观察AH是否能有效抑制EMT过程，从而延缓肺纤维化的进展。

实验结果显示，AH治疗在BLM诱导的肺纤维化模型中产生了多维度的改善效果。具体表现为有效缓解病理组织损伤和呼吸功能障碍，减轻肺部炎症反应和胶原沉积。在机制层面，研究团队通过整合转录组分析和实验验证，发现AH的抗肺纤维化作用主要通过调控PI3K/AKT/GSK3β信号通路实现。该信号通路在IPF的发展中起着关键作用，通过调控细胞增殖、凋亡和EMT过程，影响肺纤维化的进程。已有研究表明，当肺泡Ⅱ型细胞受到损伤时，会引发线粒体功能障碍，进而导致活性氧（ROS）的增加和分泌。ROS的升高会氧化PI3K的p85亚基，促进PIP3的合成，激活Akt并引发其磷酸化，从而抑制肺泡上皮细胞的凋亡，促进EMT，最终导致肺纤维化的发生。而使用ROS清除剂NAC后，肺组织中的磷酸化Akt水平显著降低，PI3K/AKT信号通路被抑制，EMT过程被逆转，肺纤维化病变明显减少。这些发现进一步支持了PI3K在纤维化过程中的重要作用。

此外，研究团队还探讨了PI3K在肺纤维化中的具体作用机制。例如，An等人（2020）通过研究PI3Kγ基因敲除的小鼠模型，发现PI3Kγ的缺失能够抑制肾纤维化的发展，减少髓样成纤维细胞的积累，并减轻肾组织中肌成纤维细胞的转化。同样，研究团队通过使用PTEN条件性缺失的转基因小鼠模型，发现PTEN功能的丧失会导致PI3K/AKT通路的异常激活，从而抑制肺泡上皮细胞的凋亡，加剧由博来霉素诱导的肺纤维化。这些研究进一步表明，调控PI3K/AKT/GSK3β信号通路可能是治疗IPF的一种可行策略。

尽管PI3K/AKT通路已被确认为IPF发展中的关键通路，但开发直接抑制该通路的药物面临一定的挑战，主要是由于潜在的毒副作用。相比之下，将已知安全的、传统药物组合用于IPF治疗仍是一个未被充分探索的方向。因此，本研究通过建立体内和体外模型，系统评估了AH的抗纤维化效果，并探索其作用机制。研究结果表明，AH能够通过抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路，有效延缓肺纤维化的进展，这为IPF的预防和治疗提供了新的实验依据和理论支持。

在实验过程中，研究团队还对实验材料和试剂进行了详细说明。例如，博来霉素是从北京的Harveybio公司获得的，青蒿素是从四川的Sichuan Tongrentai Co., Ltd.获得的，羟氯喹硫酸盐（纯度≥98.0%）则从江苏的Shenhua Co., Ltd.获得。尼达尼布是从上海的Macklin公司获得的，CCK-8试剂（用于细胞活性检测）则从武汉的Elabscience公司获得。TGF-β1生长因子是从苏州的Nearshore Protein公司购买的，用于检测的抗胶原Ⅰ抗体（ab138492）也从相关供应商处获得。这些材料和试剂的选择确保了实验的准确性和可重复性。

在具体实验操作中，研究团队首先建立了TGF-β1诱导的A549细胞EMT模型，以评估AH是否能有效抑制EMT过程。通过CCK-8实验，研究团队发现AH在浓度高达100 μM时对A549细胞的细胞毒性较低，因此后续实验采用25、50和100 μM的浓度进行分析。而BIBF在0-1 μM范围内未表现出细胞毒性，因此实验中采用1 μM的浓度进行测试。Western blot实验结果显示，TGF-β1刺激显著促进了EMT相关蛋白的表达，而AH的加入能够有效抑制这些蛋白的表达，从而延缓EMT过程。这些实验数据进一步支持了AH的抗纤维化作用。

在讨论部分，研究团队指出，IPF不仅是多种间质性肺疾病的终末阶段表现，还常因渐进性呼吸衰竭或继发性心血管事件导致死亡。近年来，IPF的发病率和死亡率均有所上升，但现有的治疗策略仍无法满足临床需求。因此，开发更安全、更有效的抗纤维化药物成为临床实践中的关键任务。本研究通过系统评估AH的抗纤维化效果，为IPF的治疗提供了新的思路。研究结果表明，AH不仅能够有效抑制EMT和ECM沉积，还能通过调控PI3K/AKT/GSK3β信号通路，延缓肺纤维化的进展。这一发现为传统药物的再利用提供了新的可能性，并突显了AH在IPF治疗中的潜在价值。

研究团队还强调，AH的抗纤维化作用机制可能与传统中医理论中的“清热凉血”作用相契合。青蒿素在传统中医中被认为具有清热、凉血和解毒的功效，而现代研究发现，其药理作用不仅限于抗疟疾，还涵盖了抗炎、免疫调节和抗纤维化等多个方面。这种多靶点、多通路的特性使得AH在治疗复杂疾病如IPF时具有独特的优势。此外，AH的使用还可能带来更好的治疗效果和更低的副作用，为患者提供更优质的治疗选择。

综上所述，本研究通过系统实验验证了AH在治疗IPF方面的潜力，并揭示了其作用机制。研究结果不仅为传统药物的再利用提供了新的视角，也为IPF的治疗策略带来了新的可能性。随着对AH作用机制的进一步探索，未来有望开发出基于AH的新型抗纤维化药物，为IPF患者提供更安全、更有效的治疗方案。