在下游处理过程中，流体动力学应力、机械应力及界面应力对腺相关病毒8型和9型的影响

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open》：Impact of Hydrodynamic, Mechanical, and Interfacial Stress during Downstream Processing on Adeno-Associated Virus Serotype 8 and 9

　　腺相关病毒载体（AAV8/AAV9）在生物制药生产中遭遇的物理应力（泵送、剪切流、空液界面等）对其完整性和质量的影响。研究发现泵送导致可溶AAV显著损失，AAV8更敏感且易形成颗粒，但高剪切率（20,000 s?1）单独作用不影响 titers，提示需优化泵送参数以确保质量稳定。

　　在基因治疗领域，腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）已成为一种备受关注的递送载体。其广泛的应用得益于AAV具有广泛的细胞亲和性、良好的安全性和在不同组织中能够实现长期转基因表达的能力。随着AAV在多种疾病治疗中的临床成功，对高效、可扩展的AAV生物制造工艺的需求也在不断增长。然而，目前的AAV大规模生产仍面临诸多挑战，特别是在过程控制和产品质量稳定性方面。为了确保AAV在制造过程中保持其生物活性和结构完整性，需要深入理解各种物理应力对其的影响。

AAV是一种小型、无包膜的病毒，属于**Parvoviridae**病毒科，其基因组为单链DNA，长度约为4.7 kb，被包裹在一个直径约25 nm的二十面体蛋白质衣壳中。衣壳由VP1、VP2和VP3三种病毒蛋白组成，比例为1:1:10。在实际生产中，AAV的衣壳结构和病毒颗粒的完整性对治疗效果至关重要。因此，了解AAV在制造过程中如何应对不同的物理应力，如泵送、剪切力、拉伸流、空化、机械应力和气液界面等，对于优化工艺流程、提高产品质量和确保治疗效果具有重要意义。

在生物制造过程中，AAV溶液会经历多种物理操作，例如泵送、搅拌、过滤等。这些操作产生的物理应力可能会对AAV的结构和功能造成影响，进而影响最终产品的质量。例如，剪切力可能引起AAV颗粒的聚集或断裂，而空化则可能通过形成和崩溃气泡产生剧烈的物理效应，导致蛋白质变性或病毒颗粒损伤。此外，气液界面和固液界面的接触也可能促进AAV的聚集或形成颗粒。这些现象在抗体等蛋白质的生产过程中已有较多研究，但对于AAV这类病毒载体，相关研究仍较为有限。

本研究聚焦于两种最常见的AAV血清型——AAV8和AAV9，评估了它们在不同物理应力下的表现。研究采用了缩尺模型，模拟了实际生产中可能遇到的各种应力条件，包括泵送、透析（TFF）操作、泵送与剪切力结合、泵送与拉伸流结合、机械应力、泵送与空化结合，以及泵送与气液界面接触等。通过一系列分析手段，如测定溶液中可溶性AAV浓度、衣壳完整度、衣壳分子量和大小、颗粒形成情况以及热稳定性等，研究人员评估了这些物理应力对AAV的影响。

研究结果表明，几乎所有涉及泵送的操作都会导致可溶性AAV的显著损失，且这种损失在AAV8中更为明显。AAV8不仅在泵送过程中表现出更高的损失率，还显示出更强的颗粒形成倾向。相比之下，AAV9在相同条件下损失较小，且颗粒形成的情况相对较少。这表明AAV8对物理应力更为敏感，而AAV9则具有一定的抗压能力。然而，值得注意的是，当单独施加高剪切力（高达20,000 s?1）时，两种血清型均未表现出显著的结构或功能变化。这一发现说明，AAV在面对剪切力时具有一定的稳定性，但泵送过程中可能伴随的多种复合应力仍然是影响AAV质量的关键因素。

此外，研究还发现，物理应力并未导致AAV出现新的大小或分子量变异体，且对衣壳的热稳定性和聚集起始温度没有明显影响。这意味着，尽管物理应力可能引起AAV颗粒的损失或聚集，但不会改变其基本的物理化学特性。这一结果对于评估物理应力对AAV的影响具有重要意义，因为它表明在某些情况下，AAV仍能保持其核心结构和功能。

在生物制造过程中，TFF（切向流过滤）和填装/灌装（fill/finish）操作是AAV生产中常见的步骤，但这些步骤也与AAV的损失密切相关。研究指出，TFF和填装操作可能导致AAV的显著损失，这一现象通常被归因于剪切力引起的病毒聚集。然而，目前尚无明确的实验证据支持AAV对剪切力的敏感性，也没有详细的研究阐明不同类型的物理应力对AAV结构和功能的具体影响。因此，本研究不仅填补了这一知识空白，还为优化AAV生产流程提供了重要的数据支持。

从实际应用的角度来看，研究结果强调了在AAV生产过程中优化泵送参数的重要性。泵送作为AAV制造中的关键步骤，其参数设置直接影响到病毒颗粒的稳定性和产量。因此，科学地调整泵送速度、压力、管道材质和操作方式，有助于减少AAV的损失并提高生产效率。同时，研究也表明，单独的高剪切力并不一定会导致AAV的显著损伤，这为未来开发更高效的剪切力控制技术提供了方向。

在当前的AAV生产流程中，通常包括细胞培养、裂解、澄清、核酸酶处理、TFF浓缩、亲和层析捕获、纯化和最终制剂等步骤。其中，TFF和亲和层析是两个关键的环节，它们不仅用于浓缩AAV，还用于去除杂质和空衣壳。然而，这些步骤中所涉及的物理应力可能会对AAV的结构和功能产生不利影响。因此，如何在这些步骤中减少物理应力的负面影响，是提高AAV生产质量和效率的重要课题。

为了更全面地评估物理应力对AAV的影响，本研究采用了多种分析技术，包括测定溶液中可溶性AAV的浓度、衣壳完整度、衣壳分子量和大小、颗粒形成情况以及热稳定性等。这些分析方法能够从不同维度揭示AAV在物理应力下的行为，从而为工艺优化提供依据。例如，通过测定衣壳完整度，可以了解物理应力是否导致了AAV颗粒的破裂或聚集；通过分析颗粒形成情况，可以评估不同应力条件对AAV结构的破坏程度；而热稳定性测试则有助于判断物理应力是否影响了AAV在不同温度下的表现。

研究结果还指出，AAV在面对物理应力时表现出一定的抗性，尤其是在高剪切力条件下。这一发现对于设计和优化AAV生产流程具有重要指导意义。例如，在某些需要高剪切力的操作中，如灌装过程，AAV仍能保持其结构和功能的完整性。因此，未来在这些操作中可以更放心地使用高剪切力，而不必过度担心对AAV的影响。然而，这并不意味着可以忽视其他类型的物理应力，如空化、气液界面接触等，这些应力仍然可能对AAV的完整性造成影响。

总体而言，本研究揭示了AAV在生物制造过程中对不同物理应力的响应机制，并强调了优化泵送参数的重要性。这些发现不仅有助于提高AAV生产过程的可控性和一致性，还为未来开发更高效的基因治疗载体提供了理论依据和技术支持。随着AAV在基因治疗中的广泛应用，深入理解其在制造过程中的行为将有助于推动该领域的进一步发展。