《Clinical Medicine》：Complex pathways to ceftolozane-tazobactam resistance in clinical
Pseudomonas aeruginosa isolates: a genomic epidemiology study
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本研究通过整合新型机构数据与公开测序数据，系统分析铜绿假单胞菌耐头孢曲松/他唑巴坦机制。采用全基因组测序和 broth microdilution 检测，结合GWAS和机器学习分析，发现20.4%菌株耐药，其中碳青霉烯酶基因检出率12.2%。除已知基因ftsI、ampC、ampR外，首次鉴定PA3329和PA4311为新耐药相关基因，并证实PBP3的R504C突变显著降低药物结合亲和力。
Hoai-An Nguyen|Anton Y. Peleg|Jiangning Song|Jessica A. Wisniewski|Luke V. Blakeway|Gnei Z. Badoordeen|Ravali Theegala|Nhu Quynh Doan|Matthew H. Parker|David L. Dowe|Nenad Macesic
澳大利亚墨尔本莫纳什大学阿尔弗雷德医院及转化医学学院传染病科
摘要
目的
我们旨在通过结合机构内部数据与公开可用的测序数据，对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的头孢托拉宗/他唑巴坦（C/T）耐药机制进行全面的基因组分析。
方法
我们分析了1,682株铜绿假单胞菌分离株，其中339株来自阿尔弗雷德医院（澳大利亚墨尔本），1,343株来自六个公共数据集。所有分离株均接受了全基因组测序和C/T肉汤微稀释（BMD）敏感性测试。我们评估了先前报道的固有和获得性耐药机制。随后，我们进行了全基因组关联研究（GWAS）和机器学习分析，以识别与耐药性相关的新基因，并评估这些基因突变对最低抑菌浓度（MIC）值和头孢托拉宗结合亲和力的影响。
结果
在1,682株代表527种不同序列类型的铜绿假单胞菌分离株中，有343株（20.4%）对C/T具有耐药性。在206株（12.2%）分离株中检测到了碳青霉烯酶基因。先前报道的耐药相关基因（ftsI, mpl, ampD, ampC, ampR, oprD）的突变在耐药分离株中更为常见，但在几乎所有敏感分离株中也存在。连续突变导致MIC值呈叠加性增加。结合GWAS和机器学习分析预先确定了五个与耐药性显著相关的关键基因：ftsI、ampR、ampC、PA3329和PA4311。分子对接模拟显示，由ftsI编码的青霉素结合蛋白3（PBP3）中的R504C突变减少了与头孢托拉宗的结合接触和氢键，显著降低了结合亲和力（P=0.016）。
结论
我们对1,682株铜绿假单胞菌基因组的分析表明，C/T耐药性具有复杂的途径，并表明ftsI可能发挥了被低估的作用。我们发现了两个之前未鉴定的与C/T耐药性相关的基因，其功能仍有待确定。
引言
铜绿假单胞菌是一种主要的革兰氏阴性病原体，2021年全球因抗菌素耐药性（AMR）导致的死亡中占9.4%1。多重耐药（MDR）铜绿假单胞菌占铜绿假单胞菌感染总数的15-30%2，严重限制了可用的治疗选择。因此，头孢托拉宗-他唑巴坦（C/T）已成为治疗MDR 铜绿假单胞菌感染的一线药物3。然而，MDR 铜绿假单胞菌中的C/T耐药率可高达18.4%4。这凸显了迫切需要了解C/T耐药机制，以便快速识别耐药分离株并更好地控制其传播。
导致C/T耐药性的途径有多种
5。其中，AmpC β-内酰胺酶的结构改变是最常见的机制
6, 7, 8。由于调节基因（
ampD、
ampR、
dacB和
mpl）的突变导致的AmpC过度产生也会引起耐药性
6, 7。获得性AMR基因，如碳青霉烯酶或广谱β-内酰胺酶，由于能够水解头孢托拉宗，也是另一种主要机制
8, 9。
以往关于C/T耐药性的研究主要集中在病例系列和已描述的机制上7, 8, 10。然而，不同耐药机制之间的复杂相互作用仍不甚明了，新耐药决定因子的识别也受到限制。为填补这些空白，我们利用机构内部的新数据以及所有公开可用的具有匹配C/T敏感性表型的铜绿假单胞菌基因组，全面确定了C/T耐药机制。具体而言，我们旨在评估已知耐药机制的流行情况，然后通过全基因组关联研究（GWAS）和机器学习（ML）方法识别新机制（图1）。
部分摘要
细菌分离株收集
该研究已获得阿尔弗雷德医院伦理委员会的审查和批准（项目编号185/21）。我们分析了2004-2021年间在阿尔弗雷德医院（澳大利亚墨尔本）收集的339株铜绿假单胞菌分离株，该医院是一家拥有囊性纤维化和肺移植转诊服务的638张床位的四级医院。连续的铜绿假单胞菌分离株来自临床标本。这些分离株包括 matte型和黏液型，储存在-80°C的甘油肉汤中。
数据特征
我们分析了来自四大洲（亚洲、欧洲、北美、大洋洲）的1,682个铜绿假单胞菌基因组（补充文件1），包括阿尔弗雷德医院的分离株（339/1,682，20.2%）和六个公共数据集（1,343/1,682，79.8%）5, 11, 12, 13, 14, 15。在1,682株分离株中，有343株（20.4%）对C/T具有耐药性。我们检测到了527种序列类型（STs）（补充图1）。全球广泛存在的MDR谱系铜绿假单胞菌 ST235最为常见（163/1,682，9.7%），占C/T耐药分离株的78%（22.7%）
讨论
这项对1,682株铜绿假单胞菌分离株的全面基因组分析揭示了多种导致C/T耐药性的机制，包括已知的耐药决定因子（ftsI、ampC和ampR）以及新的候选基因（PA3329和PA4311）。ftsI在多次分析中被证实是C/T耐药性的关键因素。这些发现得到了多种方法学优势的支持。我们的研究利用了一个大型、地理分布广泛的数据集，涵盖了新的和公开的基因组
作者贡献
HA.N、N.M.和A.Y.P.提出了这项研究。J.A.W.负责设计和监督细菌分离株的采样和收集工作。J.A.W.、L.V.B.、G.Z.B.、R.T.、N.Q.D.和M.H.P.负责收集细菌分离株，进行细菌特征分析、基因组测序和肉汤微稀释实验。HA.N.预处理了WGS数据。HA.N.、J.S.、D.L.D.和N.M.设计了机器学习分析。HA.N.进行了GWAS并开发了机器学习模型。HA.N.和N.M.分析了所有结果。
资金支持
这项工作得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（Nemerging Leader 1 Fellowship APP1176324资助给N.M.，Practitioner Fellowship APP1117940资助给A.Y.P）以及澳大利亚医学研究未来基金（FSPGN000048）的支持。
资助方未参与研究设计、数据收集和解释，也未参与决定提交论文发表。
利益冲突
N.M.曾从葛兰素史克公司获得与当前研究无关的研究支持。A.Y.P.通过一个由研究者发起的研究项目获得了MSD的研究资助。其他所有作者均声明没有利益冲突。
致谢
这项工作得到了莫纳什eResearch Centre的支持，包括M3服务。此外，还使用了Nectar Research Cloud，这是一个由NCRIS资助的澳大利亚研究数据共享平台（ARDC）支持的协作研究平台。
