ACE基因Alu I/D多态性与男性不育的南斯拉夫病例对照研究及多组学整合分析

　　本研究通过南斯拉夫人群病例对照分析，首次系统评估ACE基因Alu插入/缺失（I/D）多态性与严重生精障碍（非梗阻性无精症NOA和严重少弱畸精子症OAT）的关联，并结合多组学（基因组学、表观基因组学、miRNA组学等）数据构建ACE调控图谱，为男性不育的分子机制提供新视角。

　　

Abstract

肾素-血管紧张素系统（RAS）组分在男女生殖道均有表达，动物模型研究表明血管紧张素I转换酶（ACE）对男性生殖功能具有重要作用。研究最广泛的ACE基因多态性是Alu插入/缺失（I/D），该变异被认为可能对男性生育力产生负面影响。鉴于文献中存在争议性证据，我们开展了一项多中心病例对照研究，旨在探讨ACE基因Alu I/D多态性与生精障碍之间的关联。通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，我们对745名南斯拉夫男性进行了ACE基因Alu I/D多态性基因分型。研究组包括457名生精障碍患者（其中239名为非梗阻性无精症NOA，218名为少弱畸精子症OAT），对照组为288名已生育男性。结果显示，Alu I/D多态性与这些精液表型之间未发现关联，表明该多态性可能与本队列中的NOA或严重OAT无关。为了提供更广泛的调控背景，我们还利用基因组学数据库和生物信息学工具，通过计算机多组学分析，构建了ACE调控元件的整合图谱。数据整合揭示了多个组学层面的各种调控机制，包括基因组学、表观基因组学、miRNA组学、转录组学、蛋白质组学和翻译后修饰组学。这些机制包括预测具有有害效应的基因组变异、CpG岛、microRNA（miRNA）和翻译后修饰（PTM）。此外，蛋白质相互作用分析表明，ACE间接连接到多个先前与男性不育相关的蛋白质，并且也被先前与少精子症相关的miRNA所靶向。这种结合遗传关联分析与生物信息学的综合性、多层面研究方法，为在更广泛的分子背景下理解ACE的调控提供了见解。这些结果强调了进一步开展整合性多组学和系统生物学研究对于更好地理解ACE在男性生殖功能中作用的重要性。

Introduction

男性不育影响着约2.5%至12%的成年男性。由于其病因异质性及遗传与环境因素的相互作用，诊断颇具挑战性。在不育男性中已观察到多个组学水平的异常，但目前仅有有限数量的遗传因素（如染色体异常和Y染色体微缺失）被常规检测。常见遗传变异可能对不育的贡献较小，但由于其在人群中频率较高，其作用不容完全排除。

男性生殖道中存在肾素-血管紧张素系统（RAS）组分，提示生殖功能与RAS之间可能存在联系。RAS包括AGT、ACE、ANG II和AGTR1等组分，这些组分与精子活力、卵子受精和早期胚胎发育等多种生育相关过程有关。

血管紧张素I转换酶（ACE）是RAS系统的关键酶。它存在两种亚型：较大的体细胞亚型（sACE），在各种组织中表达；以及较短的精子细胞亚型（tACE），也称为生殖亚型（gACE），仅在成年睾丸中表达，由外显子13-26编码。动物研究表明，缺乏两种ACE亚型的小鼠表现出精子运输和受精缺陷，而仅缺乏体细胞亚型（sACE）的小鼠仍具有生育能力，证实了tACE而非sACE在正常雄性生殖中的关键作用。

有研究提示ACE基因多态性可能与男性不育有关，但结果不一致。一项针对新加坡华人不育男性的研究分析了五个ACE基因单核苷酸多态性（SNP），未发现与男性不育显著相关。相反，另一项研究表明，ACE基因中的rs4316多态性与精子中缺乏生殖ACE以及体外受精（IVF）结果不佳相关。除了SNP，另一个常研究的ACE变异是Alu插入/缺失（I/D）多态性。该多态性涉及ACE基因内含子16中一段287碱基对（bp）的Alu序列的插入或缺失。有报道称，携带D/D和I/D基因型的男性表现出异常的精液参数，从而加强了ACE I/D多态性与男性不育的关联。然而，也有研究未观察到不育男性与对照组之间基因型或等位基因频率的显著差异。

鉴于关于ACE Alu I/D多态性在男性不育中作用的证据存在冲突，本研究旨在通过一项涉及南斯拉夫不育男性和已生育对照的多中心病例对照研究，探讨其与男性生育力受损的潜在关联。为了获得对ACE调控的全面概览，我们构建了一个整合了多个组学层面数据的整合图谱，以进一步探索其对未来研究的潜在意义。

Results

病例对照研究

分析显示，对照组的基因型分布未出现显著偏离Hardy-Weinberg平衡的情况。在非梗阻性无精症（NOA）患者与对照组之间、少弱畸精子症（OAT）患者与对照组之间，或所有生精障碍患者与对照组之间，均未发现等位基因或基因型频率的显著差异。ACE Alu I/D多态性在病例和对照组中的基因型及等位基因频率见表1和图1。此外，在等位基因模型、显性模型和隐性模型中均未观察到显著差异（表2）。我们曾计划按人群进行亚组分析以评估可能的种族差异，但由于来自其他国家的参与者样本量太小，无法进行可靠的种族间比较，因此仅对斯洛文尼亚队列进行了额外分析。同样，在任何测试的遗传模型中均未发现基因型或等位基因频率的显著差异。

整合性多组学ACE调控元件图谱

整合性ACE调控元件图谱的结果概览见图2A。数据提取自14个基因组学数据库和生物信息学工具。我们汇编了与ACE相关的多个组学层面的分子数据，包括基因组学（DNA水平）、表观基因组学、miRNA组学、转录组学（RNA水平）、蛋白质组学和翻译后修饰组学（PTM）。

虽然我们的主要遗传关联分析聚焦于内含子16的ACE Alu I/D多态性，但我们通过使用Ensembl浏览器提供的六种成熟预测工具（SIFT、PolyPhen、CADD、REVEL、MetaLR和Mutation Assessor）提取临床显著和潜在致病性变异，扩展了本研究的生物信息学部分。分析确定了七个错义变异，其中六个被所有六种工具归类为有害。其中一个变异（rs2029861365）也被注释为剪接区变异。根据Ensembl数据库，这些变异的临床意义目前未知。然而，ACE基因也包含被分类为致病性的变异，包括rs983649759（框内缺失和插入）、rs367797185（终止增益）和rs1219522144（移码），以及一个可能致病的错义变异rs148491967。这些结果表明，其他ACE变异可能具有功能相关性，应在未来的病例对照研究或功能实验中被优先考虑，以阐明其在男性不育中的潜在作用。

我们研究了ACE的表观遗传调控，重点关注DNA甲基化模式和可能靶向该基因的miRNA的鉴定。我们的分析揭示了一个长达1,266 bp的CpG岛，从ACE的上游区域延伸至内含子1，CG含量超过80%。实验也证实miRNA hsa-miR-335-5p靶向ACE。此外，计算预测有49个miRNA可能靶向ACE，其中五个在miRDB数据库中的靶标得分达到90或以上：hsa-miR-4492、hsa-miR-4498、hsa-miR-5001-5p、hsa-miR-762和hsa-miR-4789-3p。

此外，我们研究了翻译后修饰组学水平，从PhosphositePlus数据库检索到ACE的22个PTM，包括N-糖基化（位点N111、N146、N160、N318、N509、N677、N695、N714、N760、N942、N1191）、乙酰化（K100、K136）、磷酸化（Y140、Y151、T697、T716、S824）、泛素化（Q99、K718）和甲基化（R814、R826）。N-糖基化是最常见的PTM。在氨基酸位置100和700附近观察到较高的PTM密度（图2A）。

先前已报道ACE有两种亚型：精子细胞亚型和体细胞亚型。目前，Ensembl数据库中注释了21个人类和4个小鼠ACE转录本。正如文献所述，ACE在转录本和蛋白质水平上均存在差异表达。使用AlphaFold预测ACE的三维结构，我们发现该蛋白质由两个不同的结构域组成。

使用STRING工具的进一步分析显示，ACE与八个蛋白质相互作用，其中大多数主要参与RAS信号通路。虽然ALB、KNG1和BDKRB2不直接属于RAS通路，但它们与血管和血压的维持密切相关。富集分析证实了这一点，显示ACE及其相互作用蛋白质主要与调节血管直径和维持血压等生物过程相关（图2A）。将STRING分析扩展到蛋白质相互作用网络中的一级邻居，识别出另外12个蛋白质（KLK4、MMEL1、NR3C2、MAS1L、CYP11B2、MME、ATP6AP2、PRCP、APLN、EDN1、F2和BDKRB1）（图3）。

Discussion

在本病例对照研究中，我们探讨了ACE Alu I/D多态性在生精障碍中的潜在作用。比较457名生精障碍男性（239名NOA和218名严重OAT）与288名已生育对照的基因型频率，未发现等位基因或基因型频率或在任何测试的遗传模型（等位基因、显性或隐性）中存在统计学显著差异。这些结果表明，ACE Alu I/D多态性与本队列中发生严重生精障碍形式（包括NOA和严重OAT）的风险无关。

几项先前的研究试图评估ACE Alu I/D多态性在男性不育中的可能作用。其中一项研究发现不育男性与对照组之间存在显著差异，而另外三项研究未观察到这种关联（表3）。除了ACE Alu I/D多态性，数据表明其他ACE多态性也可能与男性不育无关，有研究报道四种ACE SNP均与NOA无关联。结合本研究，现有文献提示ACE Alu I/D多态性在男性不育风险中不起重要作用。尽管荟萃分析是评估多项研究统计显著性的有力工具，但其在男性不育中的应用更为复杂，因为男性不育不同表型（包括无精子症、少精子症、弱精子症、畸精子症以及少弱精子症等组合形式）的纳入标准存在差异，可能导致不恰当的比较。

研究间的差异可能由样本量、种族背景、不育表型和研究的多态性不同所解释。虽然我们的结果未表明ACE Alu I/D多态性与本队列男性不育显著相关，但应谨慎解读这些结果。值得注意的是，缺乏体细胞和精子细胞两种Ace亚型的小鼠尽管精液参数正常，但受精率降低，提示ACE可能在不局限于精子发生的过程中发挥作用。同样重要的是要注意，NOA和严重OAT代表的是精液表型，而非明确的不育临床诊断。鉴于已知生育男性和不育男性在精液质量上存在重叠，我们的结论仅针对这两种表型类别，不应推广到所有形式的男性不育。需要进一步关注特定亚组（如精液参数正常但受精失败男性）的研究来澄清这种关联。

此外，基因-环境相互作用在不同人群中可能有所不同，影响研究结果的可重复性。我们的结果有助于不断增长的证据表明，ACE多态性与男性不育之间的关联是复杂的，并且可能是人群特异性的。这些差异强调了需要更大规模、种族多样化的队列、标准化表型分析和荟萃分析来澄清不一致的发现，并确定ACE在男性生育力中的作用。

尽管未发现ACE Alu I/D多态性与生精障碍受损之间存在关联，但不应在男性不育或男性生殖功能其他疾病的背景下忽视该基因作为候选基因。我们的ACE调控元件整合图谱表明，ACE在多个组学层面受到复杂调控。其他几种潜在致病性变异被不同的计算工具预测为有害。结果表明，需要对其他ACE变异进行进一步研究。

从基因上游区域延伸到内含子1的CpG岛的存在提示了可能的表观遗传调控，这与先前关于DNA甲基化影响ACE表达的报道一致。这种潜在的表观遗传调控也得到了miRNA-靶标相互作用（MTI）分析的支持，该分析确定了一个经实验验证的和49个预测的与ACE的相互作用。根据miRTarBase，hsa-miR-335-5p已被实验验证靶向ACE。此外，据报道该miRNA在少精子症男性中差异表达，并与精子浓度相关。在少精子症组中观察到的hsa-miR-335-5p表达降低表明，调控受损可能与精子数量减少有关，可能促成男性不育。

在转录水平，有报道称不育小鼠睾丸中Ace的表达与生育小鼠存在差异。在蛋白质水平，有研究报告称，与生育对照相比，不育男性射出的和获能的精子颈部和中段tACE表达减少。虽然早期研究主要关注ACE的精子细胞和体细胞亚型，但Ensembl数据库现在列出了人类21个小鼠4个转录本，反映了更高程度的可变剪接和亚型多样性，这可能有助于组织特异性调控和功能。这些结果表明，ACE在转录本和蛋白质水平上的调控改变可能与两个物种的病理状况有关。此外，来自PhosphoSitePlus数据库（一个经过实验验证的PTM数据资源）的PTM表明，ACE经历了多种修饰，包括N-糖基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和甲基化，突出了其翻译后调控的复杂性。基于这些发现，研究这些位点或附近的SNP是否会导致特定PTM的获得或丢失将是有价值的。

根据STRING数据库，ACE与八个主要参与血管维持和血压调节的蛋白质相互作用。RAS的组分参与精子生理学，并据报道在精子活力、获能、顶体反应和受精中发挥作用。尽管富集分析未揭示与男性不育的直接关联（图2A），但这些过程可能间接影响生殖功能。例如，血管舒张或收缩可以调节睾丸血流，可能影响精子发生。此外，活性氧（ROS）与男性生育力受损有关，因为它们在精子膜脂质过氧化和DNA断裂中发挥作用。氧化应激对精子活力、受精和胚胎发育有负面影响，并可能导致不育和流产风险增加。

将STRING分析扩展到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中的一级邻居，提供了对潜在功能关联的更广泛视角，并识别出另外十二个蛋白质，其中八个先前与男性不育相关。在不育男性中发现了KLK4的变异，提示可能与生育障碍有关。另一个相关基因MMEL1被发现与生育对照相比，在弱精子症男性中存在差异甲基化。根据小鼠基因组信息学（MGI）数据库，MMEL1纯合缺陷小鼠不育并表现出受精受损。MAS1L的作用尚不清楚。一项研究将该位点确定为男性生育性状的候选基因，并发现rs724078与精液参数之间存在关联，而另一项研究未能在日本人群中重复这一关联。膜金属内肽酶（MME）据报道在不育男性中过度表达。据推测ATP6AP2可能影响精子生育潜力。MGI数据库的数据证实了这一点，报告称Atp6ap2缺陷小鼠不育。此外，观察到PRCP与精子活力呈负相关，而APLN参与炎症病理状况，并据报道在不育男性中升高，尤其是在精索静脉曲张或生殖道感染男性中。据报道，与对照组相比，患有精索静脉曲张的不育男性中EDN1水平升高。

尽管本研究和大多数先前的关联研究报道ACE Alu I/D多态性与男性不育无关，但结合一级邻居蛋白质相互作用和MTI数据的更广泛网络分析揭示了网络蛋白质、miRNA和男性不育之间的联系。这些扩展的相互作用可能揭示ACE与血管功能相关生物通路之间以及可能与男性生殖健康相关的额外调控联系。

我们承认我们生物信息学研究中的部分数据是间接的，应谨慎解读。蛋白质-蛋白质相互作用数据（如来自STRING的数据）反映了预测或已知的关联，并不暗示因果关系。观察到的关联可能代表更广泛的生物过程，而非在男性生殖中的直接作用，应被视为假设，需要进一步的实验验证。基于我们的结果，整合多组学数据和应用系统生物学方法可以更全面地理解ACE在各种人类疾病中的作用。

未来的研究应调查预测为有害的SNP，特别是位于PTM位点或可能影响涉及ACE的PPI的SNP。研究位于可创建或破坏miRNA结合位点的调控区的SNP可以进一步阐明ACE的转录后调控。鉴于ACE调控的复杂性，也需要对DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传机制进行研究。ACE受miRNA和其他非编码RNA（ncRNA）的调控也值得进一步研究。未来的研究还应表征新注释的ACE亚型的表达模式、调控机制和功能意义，特别是在生殖组织中，以更好地理解其对男性生育力的潜在贡献。多组学和系统生物学方法对于全面理解ACE功能及其对人类疾病的影响至关重要。

除了这些方向，还应进行生物信息学预测效应的实验验证。虽然计算工具提供了关于致病性和调控复杂性的有价值预测，但报告基因检测、CRISPR/Cas9介导的基因组编辑和ACE亚型的体外表征等实验方法对于确定这些结果的生物学相关性至关重要。此类功能测定将有助于确认因果关系并提高本研究的转化潜力。

虽然本研究侧重于遗传和生物信息学分析，但未来的研究应考虑基因-环境相互作用，因为这些可能影响ACE变异对男性生育力的效应。吸烟和内分泌干扰物暴露等因素可能与潜在的遗传易感性相互作用。整合遗传、环境和生活方式数据对于理解男性不育的多因素性质将是必要的。

Limitations of the study

研究的一些局限性也应予以承认。一个局限是聚焦于具有南斯拉夫种族背景的患者，这可能限制结果对其他人群的普适性。多态性的遗传关联可能因人群等位基因频率和基因-环境相互作用的差异而不同。然而，这种聚焦是有意的，因为南斯拉夫人群在男性不育的遗传研究中代表性不足。

尽管考察其他种族群体（如来自塞尔维亚、黑山、克罗地亚和马其顿的男性）之间的可能差异会很有用，但由于来自其他国家的参与者数量有限，此类分析在我们的研究中无法进行。此外，该地区的人口由于历史和人口因素常常是种族混合的，难以在国家间划定清晰的遗传界限。更大的队列将增加研究的统计效力。

我们研究的一个局限是NOA和严重OAT组内的临床异质性。NOA是一个广泛的表型，涵盖各种病因，包括染色体异常、Y染色体微缺失和内分泌功能障碍。类似地，严重OAT可能源于影响精子浓度、活力或形态的各种潜在缺陷。由于并非所有中心都能获得一致的临床数据，我们无法根据遗传或激素原因对这些组进行分层。这种异质性可能稀释了ACE变异与特定男性不育亚型之间可能的关联，在解读我们的结果时应予以考虑。

关于ACE调控元件的整合图谱，应注意该图谱尚不完整，并且细胞类型特异性调控可能限制结果对不同组织和生理背景的普适性。此外，由于我们的研究依赖于生物信息学预测，必须承认这些工具有局限性，需要实验验证来确认所识别元件的功能意义。

Study highlights and implications

本研究为理解ACE在男性不育背景下的作用提供了若干重要贡献。首先，我们证明了ACE Alu I/D多态性与南斯拉夫人群中的NOA和严重OAT无显著关联。这一发现增加了证据表明这种被广泛研究的多态性可能不是生精障碍受损的重要遗传风险因素，至少在该人群组中如此。

鉴于缺乏遗传关联以及文献中的冲突结果，我们扩展了分析以考察ACE基因更广泛的分子和调控背景。通过创建ACE基因调控元件的整合图谱，我们识别了一个跨越多个组学层面的复杂调控网络，包括基因组学、表观基因组学、miRNA组学、转录组学、蛋白质组学和翻译后修饰组学。该图谱揭示了ACE可能影响生殖功能的几种潜在机制，超越了遗传变异。

使用六种成熟的致病性预测工具，我们识别了若干ACE变异，包括预测可能有害的错义和剪接区变异。这些变异代表了未来功能验证研究的有希望靶点。此外，转录后调控被强调为一个关键关注领域，涉及经实验验证和预测的与ACE的miRNA-靶标相互作用。其中一个miRNA先前与男性不育相关，突出了miRNA在精子功能和基因表达控制中的潜在调控作用。

翻译后调控也很明显，在ACE上识别出多个修饰位点，包括糖基化、磷酸化、泛素化和甲基化。这些结果支持了以下假设：影响这些修饰位点的SNP或结构变异可能改变ACE蛋白的功能，潜在地影响男性生育力。

此外，我们的PPI分析显示，ACE的几个一级邻居相互作用蛋白质已在人类或小鼠模型中与男性不育表型相关联。这一观察表明ACE可能通过其在更广泛的蛋白质网络内的相互作用，在生育调控中扮演间接角色。

最后，人类和小鼠中新注释的ACE转录本反映了高度的亚型多样性。这种转录本变异性可能有助于组织特异性基因调控和功能，特别是在生殖系统中。

综上所述，这些结果凸显了在更广泛的分子和调控背景下考察ACE的重要性。我们的多组学和系统生物学方法为研究男性不育的候选基因提供了一个有价值的框架，也可能适用于其他复杂性状和疾病。未来的研究应包括ACE基因变异及其调控机制的实验验证。

Conclusion

总之，我们的研究结果表明，ACE Alu I/D多态性不是南斯拉夫人群发生NOA或严重OAT的风险因素。然而，我们的计算机多组学分析表明，需要采用不同的组学方法进行进一步研究，以阐明ACE在男性不育中的作用。尽管未观察到与该多态性的直接关联，但ACE相互作用网络中的一个miRNA和大多数一级邻居蛋白质先前已与男性不育相关联，提示ACE可能通过转录后和蛋白质相互作用机制发挥间接作用。这种更广泛的系统水平方法可能有助于揭示ACE或其分子网络促成男性不育及相关疾病的机制。

Material and methods

患者

研究人群包括745名来自五个国家（斯洛文尼亚（卢布尔雅那）、克罗地亚（里耶卡）、马其顿（斯科普里）、黑山（波德戈里察）和塞尔维亚（贝尔格莱德）遗传中心招募的不育夫妇的男性伴侣。遗传中心包括斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学中心临床基因组医学研究所；黑山波德戈里察临床中心基因组医学与免疫学中心；塞尔维亚贝尔格莱德大学医学院人类遗传学研究所；马其顿斯科普里马其顿科学与艺术学院“Georgi D. Efremov”遗传工程与生物技术研究中心；以及克罗地亚里耶卡大学医学院医学生物学与遗传学系。

男性个体从2022年9月起在其遗传评估期间被纳入。来自国外的样本作为合作研究的一部分转移到斯洛文尼亚。在745名参与者中，457名有生精障碍，包括239名NOA和218名严重OAT。该组中，367名男性来自斯洛文尼亚，31名来自塞尔维亚，29名来自黑山，17名来自克罗地亚，13名来自马其顿。对照组由288名来自斯洛文尼亚的已生育男性组成，每人至少有一个后代。样本来自斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学中心临床基因组医学研究所的遗传生物样本库。获得了所有参与者的知情同意，他们均具有南斯拉夫血统。

参与者的选择基于欧洲泌尿外科协会和美国泌尿外科学会关于不育男性遗传检测的当前指南，这些指南建议在无精子症和严重少精子症（精子浓度<5百万/毫升）情况下进行评估。NOA定义为至少两次精液分析中完全无精子，且无导管梗阻证据。严重OAT根据WHO标准定义，涉及精子浓度降低（<5百万/毫升）、前向运动精子百分比（PR）<32%和正常形态精子百分比<4%。

DNA分离与分子分析

从外周血样本中提取基因组DNA。我们使用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析了ACE基因的Alu I/D多态性。

统计分析

使用卡方检验评估Alu I/D多态性的等位基因和基因型频率与男性生育状态之间的关联。检验了对照组基因型分布与Hardy-Weinberg平衡预测值的偏离。针对不同的遗传模型（等位基因、显性和隐性），计算了优势比及其相应的95%置信区间。p < 0.05认为差异具有统计学显著性。

整合性多组学ACE调控元件图谱

为了研究ACE的更广泛作用，我们整合了来自各种组学方法的数据，以探索其在男性不育中的潜在参与。为了检索ACE结构和探索序列变异，我们使用了Ensembl基因组浏览器。使用六种工具检索预测有害效应最高的变异：SIFT、PolyPhen、CADD、REVEL、MetaLR和Mutation Assessor。利用MethPrimer确定ACE基因中CpG岛的存在。从miRTarBase提取经实验验证靶向ACE的MicroRNAs，从miRDB数据库检索预测靶向ACE的miRNA。从PhosphoSitePlus数据库检索蛋白质翻译后修饰。使用STRING数据库分析涉及ACE的蛋白质相互作用。此外，使用Enrichr工具检查ACE及其相互作用蛋白质在生物过程方面的富集情况。为了探索其一级相互作用邻居，使用了STRING中的“add more nodes to current network”功能。使用AlphaFold蛋白质结构数据库预测ACE的结构。

伦理批准

本研究获得了国家医学伦理委员会的批准。获得了纳入研究的参与者的书面知情同意。