探索尿路感染大肠杆菌中TEM β-内酰胺酶的分子对接与动力学模拟：揭示抗生素耐药机制与治疗新策略

　　本研究通过分子对接和动力学模拟深入分析尿路感染（UTI）患者来源大肠杆菌中TEM β-内酰胺酶（TEM β-Lactamase）与多种抗生素的相互作用，揭示了一代头孢虽具强结合力却易被水解，而二代以上头孢、碳青霉烯类和氨基糖苷类因结构稳定性或不同作用机制（如核糖体或DNA旋转酶靶向）而保持疗效，强调了结合计算数据与临床结构洞察对预测耐药菌有效抗生素的重要性。

　　

Abstract

Background

尿路感染（UTIs）由大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）引起，因抗生素耐药性加剧而难以治疗，主要驱动因素为β-内酰胺酶（β-lactamase）如TEM β-内酰胺酶的生产。TEM基因变异可导致抗生素效力降低，但由此产生的TEM蛋白变体对药物结合和酶稳定性的具体影响仍未充分探索。

Purpose

本研究分析从UTI患者分离的单一E. coli菌株，通过分子对接和动力学模拟表征其TEM β-内酰胺酶与多种抗生素的相互作用，旨在更好理解影响抗生素耐药的因素并指导未来治疗策略。

Methods

从实验室收藏的临床分离株中扩增、测序TEM β-内酰胺酶基因，并基于PDB ID 1JWV翻译成蛋白模型。该模型用于通过分子对接和分子动力学模拟分析与各种抗生素的相互作用，计算结果随后与已发表的体外敏感性数据相关联。

Results

分子对接分析显示，一代头孢如头孢唑林（cefazolin）和头孢噻吩（cephalothin）对TEM-1 β-内酰胺酶表现出强结合亲和力（ΔG ≈ –8 kcal/mol），但体外测试耐药，表明易受酶水解。相反，二至四代头孢（如头孢呋辛cefuroxime、头孢噻肟cefotaxime、头孢吡肟cefepime）保持相似结合能但显示敏感，提示其结构增强了对β-内酰胺酶的抵抗力。氨基糖苷类和氟喹诺酮类显示不同结合亲和力但保留体外活性，可能因其针对核糖体或DNA旋转酶（DNA gyrase）的独特机制，不受TEM-1影响。碳青霉烯类结合能较低，仍有效，与其已知的β-内酰胺酶抗性一致。这些发现突显了耐药性的复杂性，仅结合能不能决定抗生素效力。

Conclusion

分子对接和动力学模拟揭示，后期头孢、碳青霉烯类和氨基糖苷类对TEM-1 β-内酰胺酶表现出稳定结合和结构弹性。尽管一代头孢显示强对接和稳定相互作用，其临床无效性源于酶水解。这些发现强调，将计算结合和稳定性数据与结构和临床洞察结合对预测抗TEM-1介导耐药的有效抗生素至关重要。

Introduction

尿路感染（UTIs）是全球最常见细菌感染之一，大肠杆菌是主要病原体。近年来，抗生素耐药性增加对UTIs治疗构成重大挑战。关键耐药贡献者是TEM β-内酰胺酶，属于降解β-内酰胺抗生素（如青霉素和头孢菌素）的酶家族。这些酶让细菌在抗生素存在下存活，在临床环境中尤其成问题。TEM β-内酰胺酶因在E. coli菌株中流行和对常见抗生素耐药作用而被广泛研究。

几种β-内酰胺酶TEM属超广谱β-内酰胺酶（ESBL）组，其衍生物包括TEM-1、TEM-2和TEM-3。TEM型β-内酰胺酶数量现超100。TEM-1 β-内酰胺酶是最常见，超90%氨苄青霉素耐药E. coli因TEM-1基因存在而耐药。TEM-1 1966年从名为Temoneira患者E. coli中首次识别，酶由此得名。TEM型是最大ESBL酶组，广泛传播。TEM-1能水解青霉素和一代头孢。

TEM-1 β-内酰胺酶在细菌种群中广泛存在。研究一致表明TEM-1是革兰阴性生物中最常见质粒介导β-内酰胺酶之一。其分布显著高，有些研究估计高达25%个体正常肠道菌群可能携带该基因。TEM-1广泛认可其在介导青霉素和一代头孢耐药中的作用。至今，超170种不同TEM-1酶变体在全球不同区域报道。

UTI患者E. coli中TEM β-内酰胺酶基因变异出现引发对β-内酰胺抗生素耐药增加的担忧。该基因突变可导致产生底物特异性改变或活性增强的酶，进一步复杂化感染治疗。这些基因变异可导致标准抗生素疗法失败，需要开发新药物设计和耐药管理策略。因此，理解这些基因变异背后结构特征和分子机制对解决E. coli和其他病原细菌抗生素耐药增长问题关键。

尽管对抗生素耐药和β-内酰胺酶广泛研究，我们对TEM β-内酰胺酶基因特定变异如何影响其编码酶结构和功能的理解仍存显著差距。许多研究聚焦用特定抑制剂抑制β-内酰胺酶，但TEM β-内酰胺酶不同基因变体如何影响E. coli中酶-抗生素相互作用的详细分子机制尚未完全阐明。此外，这些遗传变异如何改变酶与其他分子（如抑制剂）在临床环境中相互作用的研究有限。因此，需要更全面研究，考虑基因变异对酶行为的动态效应，特别是通过先进计算方法如分子对接和分子动力学模拟。

E. coli引起UTIs常用β-内酰胺抗生素治疗；然而，产β-内酰胺酶菌株出现显著降低其有效性。响应中，非β-内酰胺抗生素如氨基糖苷类（如庆大霉素gentamicin）和氟喹诺酮类（如环丙沙星ciprofloxacin）因不同作用机制而被用作替代治疗，这些机制在β-内酰胺耐药存在下仍可有效。尽管如此，新证据显示对β-内酰胺和非β-内酰胺抗生素类别共耐药增加，对当前治疗策略构成严重威胁。这增长耐药突显迫切需要更好理解抗生素与耐药相关酶（如TEM-1 β-内酰胺酶）相互作用，并探索可能恢复抗菌效力的潜在抑制剂。

计算机筛选方法如分子对接和分子动力学已成为药物发现和开发基本工具。分子对接让研究人员预测小分子如配体如何与更大分子如蛋白质相互作用，通过模拟结合过程。该方法帮助识别关键结合位点并计算结合能，提供化合物作为治疗剂潜力的初步理解。此外，分子动力学通过模拟原子和分子随时间运动提供更动态视图，给出配体-受体复合物稳定性和灵活性洞察。这些互补技术提供预测天然化合物与其靶蛋白相互作用的强大方法。

本研究旨在通过分析从UTI患者分离E. coli中TEM β-内酰胺酶基因变异，并使用分子对接和分子动力学模拟预测编码TEM β-内酰胺酶蛋白如何与各种抗生素相互作用，以解决现有研究差距。本研究中分析TEM β-内酰胺酶基因获自印度尼西亚万隆Ibrahim Adjie社区卫生中心患者收集细菌分离株。该分离株显示对青霉素、青霉素-舒巴坦和一代头孢耐药。

本研究将提供对来自UTI患者E. coli分离株TEM β-内酰胺酶基因产生复杂分子相互作用及其对常用抗生素影响的宝贵洞察。通过采用分子对接和分子动力学模拟，研究旨在预测基因如何影响编码TEM β-内酰胺酶蛋白结构和功能，影响药物结合和稳定性。最终，这理解将有助开发更有效治疗策略。此外，研究有潜力发现新药物候选或优化现有治疗，对管理抗生素耐药和推进细菌-抗生素相互作用知识有显著意义。

Materials and Methods

Bacterial Isolate

本研究使用细菌为药学系微生物与生物技术部门实验室收藏菌株，原分离自印度尼西亚万隆市Ibrahim Adjie公共卫生中心（Puskesmas）患者，并已进行对几种抗生素耐药测试。本研究使用临床样本获自作为常规临床程序部分收集的患者样本，遵循参与者书面知情同意获取。该临床样本使用获Padjadjaran大学伦理委员会批准（伦理批准号：51/UN6.KEP/EC/2018），研究根据人类受试者研究伦理指南和赫尔辛基宣言原则进行。分离细菌已测试其对各种抗生素敏感性。这些抗生素，连同阿米卡星（amikacin）和环丙沙星（ciprofloxacin），也用于分子对接和动力学模拟研究。

Identification of a TEM β-Lactamase-Encoding Gene

Isolation of Bacterial Chromosomal DNA

细菌染色体DNA分离使用PureLink? Genomic DNA Mini Kit（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）根据制造商协议进行。细菌细胞重悬于180 μL PureLink? Genomic Digestion Buffer和20 μL Proteinase K，随后55°C孵育30分钟。加入RNase A Solution后，混合物孵育2分钟，接着加入200 μL PureLink? Genomic Lysis/Binding Solution和200 μL乙醇。裂解液离心，用PureLink? Genomic Wash Buffers I和II洗涤，然后DNA用200 μL PureLink? Genomic Elution Buffer洗脱。分离染色体DNA随后用作扩增TEM编码基因模板。

Amplification of the TEM-Encoding Gene

PCR包括三个阶段：变性、退火和延伸。进行PCR，2 μL DNA用于50 μL混合物，含1x PCR缓冲液、200 μM脱氧核苷三磷酸、0.4 pM/μL引物和1 U Taq聚合酶。扩增进行初始变性94°C 10分钟，随后30循环94°C 40秒、60°C 40秒和72°C 1分钟，最终延伸72°C 7分钟。使用引物：MultiTSO-T_for 5’-CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3’和MultiTSO-T_rev 5’CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC-3’。DNA扩增使用Biometra TProfessional热循环仪（Analytik Jena, Jena, Germany）进行。扩增子使用琼脂糖凝胶电泳可视化，其核苷酸序列在韩国Macrogen使用ABI 3730xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）分析，根据制造商协议。

Analysis of Sequencing Results

测序结果与公共数据库中参考序列使用基本局部比对搜索工具（BLAST）比对。随后进行获得序列与参考TEM编码基因间序列比对以识别变异或突变。

Molecular Docking and Dynamics Simulations

Ligand Preparation

配体准备过程开始于从PubChem数据库检索抗生素化学结构，格式为.sdf，包含准确分子对接和动力学模拟必需3D结构数据。这些结构随后导入Avogadro进行几何优化，使用MMFF94力场，确保配体采用最稳定构象。优化分子随后转换为.pdb格式，使其适合进一步计算研究，包括对接和分子动力学分析以评估其与E. coli TEM β-内酰胺酶相互作用。

这些抗生素—阿米卡星、氨苄青霉素（ampicillin）、萘啶酸（nalidixic acid）、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶（ceftazidime）、头孢呋辛、头孢噻吩、庆大霉素、左氧氟沙星（levofloxacin）、美罗培南（meropenem）、氧氟沙星（ofloxacin）、头孢唑林、舒巴坦（sulbactam）、妥布霉素（tobramycin）、亚胺培南（imipenem）和环丙沙星—用于分子对接和动力学模拟以评估其与靶蛋白潜在相互作用。它们代表各种临床重要抗菌类别。包括氨基糖苷类有阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素。从β-内酰胺组，氨苄青霉素作为代表青霉素包括，而舒巴坦独立测试，非作为联合治疗部分。测试头孢菌素包括多代：头孢唑林和头孢噻吩（一代）、头孢呋辛（二代）、头孢噻肟和头孢他啶（三代）和头孢吡肟（四代）。碳青霉烯类，即美罗培南和亚胺培南也因广谱活性包括。从氟喹诺酮类，环丙沙星、左氧氟沙星和氧氟沙星测试。此外，萘啶酸，一代喹诺酮，包括在分析中。本研究使用细菌分离株测试其对列出抗生素敏感性，除阿米卡星、舒巴坦（作为单药）和环丙沙星。

Macromolecule Preparation

大分子准备开始于选择PDB ID 1JWV，源自通过PCR测序UTI患者样本。该结构显示与靶酶100%序列一致性，使其对结构建模和进一步分析高度可靠。PDB ID 1JWV代表TEM-1 beta-内酰胺酶突变形式结合其天然配体CB4（Pinacol[[2-amino-alpha-(1-carboxy-1-methylethoxyimino)-4-thiazoleacetyl]amino]methaneboronate）。为准备对接和分子动力学模拟结构，所有水分子、杂原子和任何非必需蛋白链仔细移除。蛋白质然后检查缺失原子或残基，任何间隙修复以确保结构完整性。最后，清洁和优化大分子保存为PDB格式，准备用作受体在后续计算实验中旨在理解UTIs中抗生素耐药机制。

Molecular Docking Procedure

分子对接使用AutoDock 4.2进行以研究抗生素与TEM-1 beta-内酰胺酶（PDB ID 1JWV）结合相互作用。由于1JWV天然配体CB4（pinacol[[2-amino-alpha-(1-carboxy-1-methylethoxyimino)-4-thiazoleacetyl]amino]methaneboronate）含硼原子，AutoDock 4.2参数集不支持，需要盲对接方法。为克服此限制，使用相关非突变结构PDB ID 1AXB天然配体，[[N-(benzyloxycarbonyl) amino]methyl]phosphate（FOS），用于识别1JWV上结合位点。PDB ID 1AXB结构近似1JWV但缺乏突变且含AutoDock兼容配体。

盲对接通过定义涵盖整个TEM-1 beta-内酰胺酶蛋白表面网格盒进行以允许无偏探索潜在结合位点。此后，聚焦对接模拟以识别结合位点为中心确保准确配体放置。对接模拟在高端计算系统上运行，配备Xeon E5 2690 V3 CPU和RTX 3060 Ti GPU，实现抗生素与酶间结合模式和相互作用能高效可靠预测。

对接协议通过比较FOS回对接进PDB ID 1AXB结合模式验证。程序考虑有效因为预测结合相互作用紧密匹配已知晶体相互作用，特别是涉及关键氨基酸Ser70、Ser130和Glu166，这些是酶活性位点关键残基。此验证确认盲对接方法可可靠识别结合位点并为突变酶1JWV进一步分析产生有意义对接结果。

Molecular Dynamics Simulations

分子动力学模拟使用GROMACS 2023在100 ns时间尺度上进行，对TEM β-内酰胺酶复合FOS和两个最高分对接配体。模拟基于最佳对接姿势并遵循标准NPT系综协议。所有模拟在高端计算系统上执行，配备Intel Xeon E5-2690 v3 CPU、32 GB RAM和NVIDIA RTX 3060 Ti GPU。系统稳定性和配体相互作用使用均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和能量谱分析评估以评估结合动力学和潜在耐药机制。

Visualising Data

数据可视化聚焦分析配体与TEM β-内酰胺酶相互作用使用分子对接和动力学模拟结果。对接指标，包括结合自由能（ΔG）、氢键和疏水相互作用，总结在比较表中关键配体-酶相互作用在3D中使用Discovery Studio Visualizer可视化。分子动力学结果，RMSD、RMSF和能量组分，使用Python分析和绘图以评估复合物在100 ns模拟期间稳定性和灵活性。这些可视化提供配体结合强度和行为动态洞察。

Results

本研究聚焦患者来源分离株产TEM-1 beta-内酰胺酶因为TEM-1仍是临床感染中最常见遇到beta-内酰胺酶之一，特别是在尿路感染（UTIs）中。尽管TEM-1已被广泛研究，临床环境中抗生素耐药持续上升，特别是在E. coli分离株中，需要持续调查其与β-内酰胺和非β-内酰胺抗生素相互作用。通过分析当前临床相关分离株，本研究旨在提供对潜在治疗选项更新洞察并探索某些非β-内酰胺抗生素可能仍保留对TEM-1生产者有效性。此真实世界相关性加强发现转化价值。

Result of TEM β-Lactamase Encoding Gene Identification

细菌染色体DNA分离结果显示DNA大小约3000–6000 kb，与预期E. coli染色体大小约4.6 Mbp一致。TEM基因PCR扩增产生产物约800 bp，匹配基于使用引物预测大小。获得核苷酸序列呈现。使用BLAST同源性搜索显示100%序列相似性与E. coli strain EA13质粒pTA13-1。进一步序列分析确认100%相似性与TEM-1基因变体。

Result of Molecular Docking and Dynamics Simulations

本研究分子对接使用AutoDock 4.2进行以研究各种抗生素与TEM β-内酰胺酶相互作用，源自UTI患者分离E. coli菌株基因序列。对接网格使用网格盒定义，以PDB ID 1JWV天然配体CB4（pinacol[[2-amino-alpha-(1-carboxy-1-methylethoxyimino)-4-thiazoleacetyl]amino]methaneboronate）为中心。

Docking Procedure Validation

各种配体结合能和抑制常数评估，包括常用治疗尿路感染（UTIs）抗生素，以评估其与E. coli TEM-1 β-内酰胺酶潜在相互作用。结合能值（ΔG, kcal/mol）指示各配体与靶蛋白相互作用强度—更负值反映更强结合亲和力。

分子对接程序验证靶向TEM-1 beta-内酰胺酶（PDB ID: 1JWV）使用AutoDock 4.2应用通过盲对接方法进行。需要盲对接因为1JWV天然配体CB4含硼原子，AutoDock 4.2参数化不支持。为克服此限制，FOS（[[N-(benzyloxycarbonyl) amino]methyl]phosphate），PDB ID 1AXB天然配体，1JWV非突变形式，用作替代配体。网格盒大小48 × 40 × 40，网格间距0.375 ?，应用中心坐标X: 14.681, Y: 10.011, Z: 37.474以覆盖整个结合区域在盲对接期间。

对接验证主要目标确保FOS，当对接至1JWV结构，能重现相同结合模式观察在FOS与1AXB天然相互作用中。此验证方法聚焦对接协议能力恢复关键分子相互作用与关键活性位点残基Ser70、Ser130和Glu166，已知对TEM-1 beta-内酰胺酶功能必需残基。因为1JWV是1AXB突变版本，确保这些相互作用保守对建立对接设置可靠性关键。

盲对接结果显示FOS确实能以模式结合一致与PDB ID 1AXB天然复合物中。对接产生结合亲和力?5.52 kcal/mol和抑制常数（Ki）89.23 μM，指示中等但生物相关相互作用。这些发现支持结论使用AutoDock 4.2对接程序成功验证并可用于进一步对接研究其他抗生素候选靶向TEM-1 beta-内酰胺酶结合位点。

Binding Energy

使用盲对接与FOS在TEM-1 beta-内酰胺酶结构（PDB ID: 1JWV）验证对接方法后，方法应用于对接范围抗生素以评估其结合亲和力和抑制常数。结合亲和力（ΔG）代表抗生素与靶蛋白相互作用强度，而抑制常数（Ki）指示需要抑制酶活性一半浓度。这两参数一起提供洞察每抗生素如何有效可能抑制TEM-1 beta-内酰胺酶，常见耐药因子对抗β-内酰胺抗生素。

测试抗生素中，庆大霉素（S09）显示最强相互作用与TEM-1，结合亲和力?9.04 kcal/mol和显著低抑制常数0.24 μM。这提示庆大霉素可能有高结合效率和抑制潜力朝向酶，尽管非经典β-内酰胺抗生素。类似，头孢唑林（S13）、头孢呋辛（S07）和头孢吡肟（S04）也演示强结合，ΔG值低于?8.0 kcal/mol和抑制常数 under 2 μM，突显其与TEM-1 beta-内酰胺酶活性位点有利相互作用。

另一方面，抗生素如FOS（此处用作对接验证对照）、舒巴坦（S14）和萘啶酸（S03）显示相对弱相互作用，结合亲和力高于?6.0 kcal/mol和Ki值 above 40 μM。这些结果提示较低抑制潜力，可能由于较弱或较少特异性结合酶活性位点。值得注意FOS非意图作为治疗抗生素在此背景但作为对接准确性参考点，其较低结合亲和力符合预期。

总体，对接结果突显几种抗生素，特别是头孢菌素和碳青霉烯类，展示强结合特性朝向TEM-1 beta-内酰胺酶。这可指示其作为有效抑制剂潜力，或至少其易受TEM-1酶降解，这将关键考虑在耐药机制中。这些发现帮助识别有希望候选为进一步实验验证和结构基础药物设计努力以克服β-内酰胺耐药。

Binding Mode

在TEM-1 β-内酰胺酶分子对接分析使用AutoDock 4.2，检查各种配体与关键氨基酸残基相互作用，聚焦氢键（HB）和疏水相互作用（HI）。氢键关键稳定配体-蛋白质复合物，而疏水相互作用贡献总体结合亲和力。结果显示不同抗生素展示变化数量和模式相互作用，帮助理解其潜在抑制效应。FOS，用作参考配体，形成5氢键涉及关键残基如Ser70、Ser130和Asn132，连同1疏水相互作用与Ala238，验证对接方法准确性识别关键接触。

比较抗生素，阿米卡星（S01）突出形成最高数量氢键（11），包括与所有三关键残基相互作用：Ser70、Ser130和Glu166。类似，头孢他啶（S06）、头孢噻吩（S08）和头孢吡肟（S04）也相互作用与Ser70和Ser130，连同其他稳定残基如Ala237、Asn132和Glu240。这些相互作用提示这些抗生素强潜力有效结合TEM-1活性位点，可能抵抗酶降解或抑制酶功能。另一方面，庆大霉素（S09），尽管其最高结合亲和力在ΔG项，未显示疏水相互作用和有较少氢键，尽管其仍包括Ser70和Glu166在其接触图。

有趣，非所有抗生素相互作用与全套重要残基。例如，舒巴坦（S14）形成氢键与Ser130但缺乏相互作用与Ser70和Glu166。这可解释其较弱结合亲和力比较其他。类似，美罗培南（S11）和氧氟沙星（S12）都相互作用与Ser130但错过Glu166，这可影响其结合稳定性和效力。这些残基相互作用谱变化强调存在或缺乏氢键与关键残基如Ser70、Ser130和Glu166可显著影响总体对接性能和预测抑制潜力。

疏水相互作用更突出在某些抗生素，如萘啶酸（S03）和头孢唑林（S13），形成达5和4疏水接触分别。尽管这些相互作用支持结合，缺乏强氢键与Glu166或Ser70在某些这些配体可能减少其抑制效率。总体，抗生素结合强氢键，特别是与Ser70、Ser130和Glu166，和互补疏水相互作用更可能显示较高结合亲和力。这些发现帮助区分哪些抗生素可能更弹性抗TEM-1酶水解并通知设计改进β-内酰胺酶抑制剂。

RMSD

分子动力学模拟100纳秒（ns）均方根偏差（RMSD）分析提供宝贵洞察抗生素结合在TEM-1 beta-内酰胺酶（PDB ID: 1JWV）结合口袋内稳定性。RMSD作为关键指示器配体从其原始对接位置移位多少随时间，值大于2.0 ?通常提示潜在脱离或不稳定在结合口袋中。分析三配体：FOS（参考配体）、庆大霉素（S09）和头孢唑林（S13）。

FOS，参考化合物，显示相对稳定相互作用在模拟前半，RMSD值保持 below 1.2 ?直至50 ns标记。然而，开始60 ns，观察到尖锐增加，RMSD尖峰至2.91 ?，指示显著位移。此不稳定持续通过模拟剩余，峰值3.65 ?在85 ns。这些发现提示FOS可能不维持稳定结合姿势在TEM-1口袋内随时间，可能由于较弱或较少有利相互作用比较其他抗生素。

对比，庆大霉素（S09）维持显著稳定RMSD谱通过整个100 ns模拟。RMSD值一致徘徊0.40和0.52 ?间，无显著波动或配体运动远离结合位点迹象。此强稳定符合早期对接结果指示高结合亲和力和有利相互作用谱，进一步支持庆大霉素强健相互作用与TEM-1 beta-内酰胺酶尽管是非β-内酰胺抗生素。

头孢唑林（S13）也演示相对稳定结合行为尽管稍多波动比庆大霉素。其RMSD保持 below 0.8 ?直至55 ns，此后些逐渐增加观察，达到约0.75 ?由模拟结束。然而，这些值保持 well below 2.0 ?阈值，提示头孢唑林维持其结合姿势在口袋内有次要调整。比较FOS，S09和S13都展示显著更稳定结合模式，突显其更强相互作用和有效抑制TEM-1潜力。RMSD数据加强结论结合稳定性，除结合能外，是评估配体有效性关键因子。

RMSF

均方根波动（RMSF）分析超过100 ns分子动力学模拟显示显著差异残基灵活性 among三抗生素，FOS、庆大霉素（S09）和头孢唑林（S13），当结合TEM-1 beta-内酰胺酶（PDB ID: 1JWV）。RMSF测量蛋白质残基从其平均位置平均偏差，帮助识别灵活性或不稳定区域。特别聚焦关键活性位点残基，特别是Ser70、Ser130和Glu166，因为这些区域波动 above 2 ?可能指示不稳定相互作用或结合口袋潜在弱化。

通过模拟，所有三抗生素保持低RMSF值在关键活性位点残基。为Ser70，RMSF值0.0407（FOS）、0.0431（S09）和0.0553（S13）；为Ser130，值0.0477（FOS）、0.0417（S09）和0.0675（S13）；为Glu166，波动0.0453（FOS）、0.0406（S09）和0.0563（S13）。所有值保持 well below 2 ?阈值，提示这些抗生素结合未诱导显著不稳定在核心催化残基。此稳定指示有效和持续相互作用潜力在结合口袋内，特别是为庆大霉素和头孢唑林。

超越活性位点，更广RMSF比较显示FOS诱导稍低波动