粪肠球菌sagA突变通过细胞包膜缺陷影响抗生素耐药性和噬菌体敏感性的机制研究

　　本文揭示了粪肠球菌(Enterococcus faecium)噬菌体抗性突变株在肽聚糖水解酶SagA基因发生突变后，导致细胞包膜完整性受损、青霉素结合蛋白(PBPs)错误定位，进而增强β-内酰胺类抗生素敏感性的分子机制。研究通过酶学实验、显微成像和渗透性测定等多重技术验证，为噬菌体与抗生素联合治疗多重耐药菌感染提供了新的理论依据。

　　

ABSTRACT

粪肠球菌(Enterococcus faecium)是一种革兰氏阳性细菌，常驻于人类等动物的肠道中，同时也是引起多重耐药(MDR)感染的机会性病原体。噬菌体作为治疗MDR感染的有潜力的替代方案备受关注，但噬菌体治疗面临的一个障碍是噬菌体抗性的出现。尽管如此，噬菌体抗性的发展可能影响细菌的适应性。因此，理解与噬菌体抗性相关的适应性代价的分子基础，可能被用作一种抗菌策略。研究发现，噬菌体抗性的粪肠球菌在细胞壁水解酶基因sagA中存在突变。SagA能够切割参与肽聚糖(PG)重塑的交联肽聚糖。研究表明，sagA突变损害了粪肠球菌的PG水解能力。其中一个sagA突变体表现出细胞包膜完整性缺陷、细胞渗透性增加和青霉素结合蛋白异常分布，同时对β-内酰胺类抗生素更为敏感。这些变化对应于生长缺陷，表现为细胞具有异常的分裂隔膜、膜泡和异常细胞形态。sagA突变引起的细胞包膜失调改变了噬菌体与粪肠球菌细胞表面的结合，其中噬菌体感染粪肠球菌需要噬菌体定位于肽聚糖重塑的位点。研究结果表明，通过改变单个PG水解酶的功能，粪肠球菌失去了固有的β-内酰胺抗性。这表明噬菌体疗法在联合使用时可能有助于恢复某些抗生素的疗效。

IMPORTANCE

粪肠球菌引起医院获得性感染，并且通常对一线抗生素（包括那些靶向细胞壁的抗生素）具有耐药性。噬菌体是对抗此类感染的有前景的替代方案。然而，细菌对噬菌体捕食的适应通常导致抗性。这种抗性常常伴随着适应性权衡，最显著的是改变了抗生素敏感性。本研究为粪肠球菌中噬菌体抗性相关的抗生素敏感性提供了机制性见解。研究表明，携带肽聚糖水解酶SagA突变的噬菌体抗性粪肠球菌具有受损的细胞包膜完整性、错误定位的青霉素结合蛋白，并变得对β-内酰胺类抗生素敏感。这些发现突出了在临床环境中将抗生素与噬菌体联合使用以恢复抗生素潜力的可能性。

INTRODUCTION

肠球菌是肠道革兰氏阳性细菌，可引起严重的全身性感染。肠球菌血流感染与高死亡率相关，并且在2019年冠状病毒病大流行后有所增加。在医学相关的肠球菌中，粪肠球菌和粪链球菌尤其令人担忧，因为它们具有医院适应性并引起医院内感染。医院内粪肠球菌感染由于该生物体对多种抗生素（包括β-内酰胺类、氨基糖苷类和万古霉素）具有固有和获得性耐药性而成为问题。值得注意的是，先前接触头孢菌素（一种β-内酰胺）是粪肠球菌感染的主要风险因素。此外，粪肠球菌的一个标志性特征是通过水平基因转移获得外源DNA而进化出抗生素耐药性，这直接促进了其作为医院适应性机会性病原体的生存能力。

人们越来越关注开发限制医院环境中肠球菌的方法，包括对高危患者进行针对性筛查、提高卫生实践以及限制住院时间。除了患者护理方面的干预措施外，治疗方法的创新，包括使用噬菌体（感染细菌的病毒）治疗多重耐药肠球菌感染，正在获得关注。尽管围绕噬菌体疗法的潜力令人兴奋，但噬菌体捕食可能在治疗期间导致噬菌体抗性细菌的出现。尽管噬菌体抗性有可能威胁噬菌体疗法的疗效，但越来越多的证据表明噬菌体抗性细菌会出现适应性约束，导致诸如抗生素敏感性增强、毒力减弱和定植缺陷等权衡。考虑到噬菌体抗性导致的适应性权衡已有充分记录并可能被治疗性利用，我们对支持这些权衡的分子机制知之甚少。

先前，研究小组发现粪肠球菌噬菌体抗性分离株对β-内酰胺类抗生素（包括氨苄青霉素和头孢曲松）更敏感。对头孢菌素的敏感性是SagA突变的结果，SagA是一种在细胞分裂过程中切割肽聚糖(PG)的水解酶。本研究利用这些菌株来研究SagA突变导致粪肠球菌β-内酰胺敏感性的机制基础。粪肠球菌sagA突变体表现出青霉素结合蛋白(PBP)在整个细胞外围的弥散性定位。此外，sagA突变体具有细胞壁形态缺陷，其特征是错误定位的分裂隔膜、细胞包膜突起和异常细胞形状，这些缺陷支持噬菌体抗性。噬菌体结合到粪肠球菌细胞表面上与活性肽聚糖合成相关的离散位点，而在sagA突变体中，噬菌体被隔离到细胞包膜突起和形状异常的细胞上，导致无效的噬菌体感染。这些发现为SagA缺陷如何导致β-内酰胺敏感性和支持噬菌体抗性的细胞壁缺陷提供了机制基础。对β-内酰胺的固有耐药性是粪肠球菌的一个常见特征，我们的研究结果支持重新考虑将β-内酰胺作为与噬菌体疗法联合使用的潜在治疗方法。

RESULTS

The peptidoglycan hydrolase domain of E. faecium SagA is required for peptidoglycan cleavage and β-lactam resistance

研究小组先前的工作表明，粪肠球菌Com12通过获得sagA基因的突变而对噬菌体9181产生抗性。sagA编码一种NlpC/P60肽聚糖水解酶，其在细胞壁重塑过程中切割交联的PG。最初认为sagA是一个必需基因，但研究恢复了NlpC/P60水解结构域关键氨基酸残基附近的多种点突变，表明这些突变使SagA功能丧失。为了测试这些噬菌体介导的SagA突变是否阻碍其PG水解活性，评估了两个独立的噬菌体抗性突变株中粪肠球菌Com12 SagA的体外酶活性。使用粪肠球菌Com12的mutanolysin消化的肽聚糖和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)-MurNAc-二肽(GMDP)的产生来测量酶活性。研究最初选择关注两个粪肠球菌突变株81R6和81R8，它们分别在NlpC/P60催化结构域具有Y451和L452之间的F插入和G435V替换。尝试纯化81R6 SagA突变体版本（Y451和L452之间的F插入）未成功。因此，为了测试该氨基酸插入位置对SagA催化活性是否关键，制作了一个在该位置插入较小疏水氨基酸亮氨酸的SagA版本。两种SagA突变体水解PG的能力均降低，表明定位于NlpC/P60催化结构域的点突变破坏了酶活性。与这一观察结果一致，Hang实验室最近表明，可以在相关的粪肠球菌Com15菌株中构建sagA的染色体缺失，进一步证实sagA为非必需基因。

先前的工作还表明，粪肠球菌SagA突变体对靶向细胞壁的抗生素更敏感，特别是对粪肠球菌固有耐药的头孢菌素。因此，为了测试SagA功能对粪肠球菌抵抗靶向细胞壁抗生素的影响，使用微量肉汤稀释法测定了针对代表性β-内酰胺类药物的最低抑菌浓度(MIC)，包括第二代（头孢呋辛）、第三代（头孢曲松）、第四代（头孢吡肟）和第五代（头孢洛林）头孢菌素、氨苄青霉素和美罗培南，以及抑制PG合成过程中脂质载体的环肽杆菌肽。sagA突变株81R6对所有测试抗生素的MIC均降低了两倍或更多，对头孢曲松（32倍）和头孢吡肟（128倍）的敏感性增强最为明显。重要的是，通过在质粒上互补sagA，粪肠球菌81R6的头孢曲松抗性得以恢复。先前的研究证实这些SagA变体在粪肠球菌中表达，表明SagA无法有效水解肽聚糖导致对靶向细胞壁的抗生素敏感化。这些观察结果与早期的发现一致，即功能性SagA的缺失导致抗生素敏感性，并将这种表型扩展到多种靶向细胞壁的抗生素。

Loss of SagA function compromises E. faecium cell wall integrity

由于SagA参与支持对称细胞分裂的PG水解，假设sagA活性的丧失会导致细胞壁完整性受损。为了验证这一点，将粪肠球菌Com12和sagA突变株81R6和81R8暴露于2%十二烷基硫酸钠(SDS)，这是一种破坏膜导致细菌细胞裂解的阴离子去污剂。当暴露于SDS时，野生型(WT)粪肠球菌经历最小的细胞裂解（通过胞质蛋白的释放测量）。作为对照，首先用溶菌酶处理粪肠球菌Com12以削弱细胞壁，然后暴露于SDS，这足以裂解细胞。粪肠球菌sagA突变体在仅用SDS处理时，释放出大量的细胞内蛋白。与粪肠球菌Com12相反，81R6和81R8两个sagA突变体在仅存在SDS的情况下释放蛋白。值得注意的是，菌株81R6在仅存在SDS的情况下的蛋白释放量与经溶菌酶和SDS处理的野生型细胞相当。通过在突变株中互补sagA，SDS抗性得以恢复。这些数据表明，SagA功能的丧失损害了粪肠球菌的细胞壁完整性。

接下来，试图确定这些噬菌体抗性sagA突变体中受损的细胞壁完整性是否导致改变的细胞包膜。为了测试这一点，进行了一项需要细胞内β-半乳糖苷酶接触不可渗透的小分子底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)的测定。从受损细胞释放的β-半乳糖苷酶将CPRG水解成有色化合物氯酚红，可以通过测量570 nm处的吸光度来定量。具有完整细胞包膜的粪肠球菌Com12对CPRG不可渗透，不发生水解。然而，sagA突变体81R6和81R8不同程度地水解了CPRG，表明存在缺陷的细胞包膜和可能增加的渗透性，导致内源性β-半乳糖苷酶从细胞中泄漏。两个菌株的菌落形成单位在一系列光密度下相似，表明细胞裂解不太可能是β-半乳糖苷酶释放的原因。当用sagA互补粪肠球菌81R6和81R8时，这种细胞包膜缺陷得以恢复。这些结果表明sagA突变体具有受损的细胞壁完整性，可能支持细胞包膜的渗透性增加。

E. faecium sagA mutants exhibit increased penetration of β-lactams and mislocalized penicillin-binding proteins

为了确定β-内酰胺是否能更容易地穿透粪肠球菌sagA突变体的细胞包膜，使用Bocillin进行了β-内酰胺渗透测定，Bocillin是一种荧光标记的4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮-s-引达省(BODIPY)标记的青霉素版本。Bocillin标记活细胞的PBP，并像其他β-内酰胺（包括头孢曲松）一样，共价结合到PBP活性位点的丝氨酸残基上，从而阻止转肽酶活性。随后的工作集中在sagA突变株81R6上，因为该菌株的头孢曲松MIC显著降低，并且经历了最大程度的细胞包膜损伤。与粪肠球菌Com12相比，81R6在不同测试浓度下显示出对Bocillin的摄取增加。由于粪肠球菌对头孢曲松的耐药性受低亲和力PBP PbpA(2b)和Pbp5以及A类PBP PonA和PbpF的调控，粪肠球菌81R6细胞包膜渗透性增加可能导致β-内酰胺快速酰化PBP，从而增强头孢曲松敏感性。为了评估这一点，首先用头孢曲松处理活跃生长的细胞以酰化可用的PBP，然后用Bocillin荧光标记任何未被头孢曲松占据的PBP。SDS-PAGE和荧光蛋白条带成像显示，在没有头孢曲松的情况下，PBP很容易被Bocillin酰化。在存在头孢曲松的情况下，未观察到粪肠球菌Com12和81R6之间Bocillin荧光条带(BFB1–6)的强度有任何显著差异。BFB1在无头孢曲松时显示高Bocillin信号，随着头孢曲松浓度增加，该Bocillin信号降低。这表明该PBP对头孢曲松的亲和力高于对Bocillin的亲和力。对于BFB2–4，观察到类似的表型。然而，BFB-5和BFB-6的Bocillin信号在测试的头孢曲松浓度下不受影响，表明这些PBP对头孢曲松亲和力低，但仍保留结合Bocillin的能力。这些数据表明，81R6细胞包膜完整性的丧失对PBP酰化模式没有实质性影响。

为了正确的细胞壁合成，PG水解酶与PBP密切合作。SagA是参与PG重塑的关键PG水解酶，因此sagA突变可能改变细胞内PBP的分布。为了测试这一点，用Bocillin染色活跃分裂的粪肠球菌Com12和81R6，并使用荧光显微镜观察PBP定位。野生型细胞显示双球菌形态，Bocillin标记在赤道和分裂隔膜处。相比之下，81R6细胞显示错误定位的Bocillin染色遍布细胞外围，并伴有随机密集的Bocillin积累位点。这些数据表明，在缺乏功能性SagA的情况下，PBP是无组织的，并且无法在细胞分裂过程中正确定位。

Peptidoglycan remodeling is altered in E. faecium sagA mutants

SagA支持粪肠球菌的细胞包膜完整性；因此，假设突变sagA会损害PG合成。为了评估这一点，分析了粪肠球菌Com12和81R6掺入3-[[(7-羟基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-3-基)羰基]氨基]-D-丙氨酸(HADA)（一种D-丙氨酸的荧光类似物）的能力。使用荧光显微镜观察，粪肠球菌Com12细胞在细胞隔膜和赤道处显示HADA染色，而81R6显示HADA均匀分布在细胞外围，表明PG合成存在缺陷。用sagA互补81R6恢复了HADA染色模式，使其与野生型细胞相同。透射电子显微镜(TEM)证实81R6菌株具有无定形的细胞形态，伴有异常的分裂隔膜、膜泡和异常细胞形状。与这些结果一致，观察到81R6与粪肠球菌Com12相比存在生长缺陷，互补后可恢复。在粪肠球菌Com15的sagA缺失菌株中观察到类似的表型，表明功能性SagA对于正确的细胞分裂具有作用。

PG水解酶活性与细胞表面电荷之间的联系已有报道。受损的细胞包膜完整性以及改变的细胞生长和分裂是细胞包膜变化的标志，这些变化可以影响细胞表面电荷。细胞表面电荷的变化可能导致细胞聚集，这是在81R6中观察到的表型，并且在粪肠球菌sagA完全缺失突变体中也已显示。因此，为了确定81R6是否具有改变的细胞表面电荷，测试了阳离子蛋白细胞色素c与细菌细胞表面的结合。更多的细胞色素c结合到81R6上而不是野生型粪肠球菌Com12，表明负电荷细胞表面电荷增加。这些数据表明，对应于81R6的sagA突变改变了整体细胞表面电荷，这可能导致了81R6的聚集表型。

接下来评估了粪肠球菌Com12和81R6中的PG合成和周转。对于PG合成，监测了[¹⁴C]N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)掺入指数生长期细胞的情况。[¹⁴C]GlcNAc掺入在整个生长过程中以相同的速率增加，表明在测试条件下，sagA的突变不影响PG合成速率。为了评估PG周转，测量了放射性标记的PG片段释放到培养上清液中的量。细胞在含有[¹⁴C]GlcNAc的培养基中生长，洗涤后重悬于含有未标记GlcNAc的培养基中。随时间测量培养介质中游离放射性的量。在生长最初2.5小时内，粪肠球菌Com12发生PG释放，然后在进入稳定期时停止。相比之下，81R6释放PG的速度更快且时间更长，表明可能由于细胞包膜完整性受损而在稳定期发生细胞裂解。

SagA directs phages to adsorb to the cell surface at sites associated with cell division

为了吸附到细菌细胞，噬菌体结合到表面分子，如多糖、碳水化合物组分和定位于细胞包膜空间不同位置的整合膜蛋白。先前的研究表明，噬菌体需要SagA进行感染，并且sagA突变不影响噬菌体对粪肠球菌细胞表面的吸附。因此，受损的细胞壁完整性和不正确的细胞分裂很可能改变了噬菌体受体的空间分布，支持非特异性噬菌体吸附并阻止DNA进入细胞。因此，用SYBR Gold荧光标记噬菌体9181，并使用荧光显微镜评估其在粪肠球菌和81R6细胞表面的分布。粪肠球菌显示整个细胞表面有点状的SYBR Gold信号，在与HADA掺入位点相关的位置信号强度略有增强。大约35%的噬菌体斑点定位于HADA阳性区域，这些区域指示分裂隔膜和细胞赤道。值得注意的是，这些HADA阳性区域占总细胞面积的18%。噬菌体与隔膜和赤道区域的关联几乎是仅基于面积预期的两倍。有趣的是，大多数81R6细胞在细胞表面显示微弱的SYBR Gold信号，而在细胞分裂改变位点、形状异常细胞附近和膜泡处有非常强烈的局部信号。认为这种强烈的集中信号可能是由于错误定位和隔离的噬菌体受体或噬菌体DNA喷射到在细胞分裂过程中未能分离的细胞区室中。通过透射电子显微镜证实了噬菌体9181吸附的这些差异，显示粪肠球菌Com12支持噬菌体在或靠近细胞赤道和隔膜处吸附。相比之下，81R6细胞显示噬菌体在离散位置聚集，同时噬菌体分布在整个细胞表面。通过sagA互补，噬菌体在细胞表面的定位恢复到野生型模式。这些结果表明，噬菌体受体协调噬菌体结合和感染整个细胞表面，并对活跃的细胞分裂位点有一定的偏好。

DISCUSSION

多重耐药肠球菌及其感染相关的治疗挑战重新引起了人们对噬菌体疗法开发的关注。噬菌体抗性的出现是成功噬菌体疗法的潜在障碍。然而，噬菌体抗性可能导致适应性代价，包括抗生素敏感化、定植缺陷和毒力降低。重要的是，这些适应性代价可以在临床上被治疗性利用；因此，广泛表征此类适应性权衡的机制基础值得进一步研究。在本工作中，探讨了缺乏功能性SagA（一种噬菌体感染所需的肽聚糖水解酶）的粪肠球菌的β-内酰胺敏感性。支持噬菌体抗性的SagA突变位于NlpC/P60水解酶结构域，并损害SagA的PG水解活性，类似于先前显示的非功能性SagA催化结构域突变体。菌株81R6中的一个特定sagA突变导致受损的细胞壁完整性、增加的细胞渗透性、PBP的弥散分布以及对β-内酰胺类抗生素（包括头孢菌素）的敏感性。此外，粪肠球菌sagA突变体在其细胞壁中显示新合成PG的不规则分布和无定形的细胞形状。这些细胞壁合成缺陷进一步支持了对头孢菌素敏感性的观察，并表明通过改变关键的PG水解酶，粪肠球菌失去了固有的头孢菌素耐药性。非功能性SagA似乎也影响噬菌体受体的空间分布，支持SagA在介导噬菌体感染中的作用。迄今为止，详细探讨SagA及其与粪肠球菌中噬菌体和抗生素耐药性联系的研究有限。我们的发现揭示了抗生素耐药性适应性代价（由噬菌体选择压力导致）之间的联系，这可能为恢复头孢菌素作为抗粪肠球菌药物的方法提供信息。

研究发现sagA突变体具有细胞壁完整性缺陷和对β-内酰胺类抗生素（特别是头孢菌素）的高度敏感性。数据显示sagA突变株81R6具有受损的细胞包膜，对小分子（包括β-内酰胺）的渗透性增加。β-内酰胺通过抑制细胞壁合成使PBP失活从而杀死细菌。给定β-内酰胺抑制PG交联的功效通常取决于其对细菌细胞表达的整个PBP库的反应性。尽管存在细胞包膜完整性缺陷，但在竞争性β-内酰胺（头孢曲松）存在下，sagA突变体81R6中的PBP被β-内酰胺占据的情况与野生型粪肠球菌相似。确实观察到sagA突变体81R6具有改变的PBP分布，这可能影响PBP的正确定位和功能，导致细胞壁合成缺陷。值得注意的是，高分子量PBP PbpA和Pbp5是粪肠球菌和粪链球菌固有头孢曲松耐药所必需的，并且这些PBP突变体共享与sagA突变株81R6相似的各种表型，包括受损的细胞壁完整性、降低的生长速率和异常的细胞形态。因此，SagA在支持固有β-内酰胺耐药性中的作用可能在于其控制PBP分布到活跃细胞分裂位点的能力。当被打乱时，诸如对β-内酰胺固有耐药的