可复现3D生物打印构建变形链球菌口腔生物膜模型：一种革新口腔微生物研究的体外仿生平台

　　本综述创新性地开发了基于3D生物打印技术的口腔生物膜体外构建方法，成功在羟基磷灰石（HA）表面实现变形链球菌（S. mutans）的空间可控沉积。该方法通过藻酸盐生物墨水（bio-ink）凝胶化技术，实现了与标准方法等效的生物量（biomass）、菌落形成单位（CFU）和环境酸化能力，同时显著提升胞外多糖（EPS）沉积量和微生物空间分布均匀性，为口腔微生物相互作用、药物筛选和生物膜动力学研究提供了革命性平台。

　　

ABSTRACT

新型研究方法对探究口腔生物膜菌株间关系、实现三维口腔生物膜沉积以及加速基础与转化研究至关重要。本研究开发了一种将3D生物打印技术从有限的软琼脂表面适配到仿生固体基质的新方法，使其能在水溶液环境中模拟口腔生物膜形成。以变形链球菌UA159为模型，比较了标准体外生物膜形成方法与新型3D打印生物墨水水凝胶在羟基磷灰石磁盘（模拟牙齿表面）上的成膜效果。结果显示，生物墨水方法形成的生物膜在毒力因子（环境pH、生物量、细胞密度）方面与标准方法无显著差异，但具有更高的胞外多糖沉积量（生物膜凝聚和保护的关键毒力因子）和更均匀的细菌微菌落空间分布。该技术为在任何基质上打印生物膜和研究多维生物膜动力学提供了新途径。

INTRODUCTION

生物膜是由微生物嵌入自身产生的胞外基质（ECM）形成的动态群落。特定微生物的优势生长会改变生物膜内部特性，包括基质密度、渗透性和粘弹性，进而影响其毒力。龋病是人类最常见的生物膜相关口腔疾病，全球年治疗费用约3,870亿美元。牙齿矿物表面的微生物积累与高糖环境共同促进致龋生物膜产酸，而菌群失调与口腔卫生不良、氟化物使用不足及社会经济因素密切相关。

变形链球菌（S. mutans）是成熟失调口腔生物膜中的优势菌种，其耐酸机制（如F-ATP酶和精氨酸脱亚胺酶系统）使其在低pH环境中存活。早期定植菌（如戈登链球菌、血链球菌）通过黏附素与羟基磷灰石表面唾液膜相互作用，为后期定植菌提供结合位点。环境变化（如高糖、pH波动）会改变种群优势、代谢和空间分布。

生物膜胞外基质主要由多糖（葡聚糖、果聚糖）、蛋白质、脂质等构成，其中α1-3键连接的葡聚糖具有高粘弹性和低渗透性。成熟致龋生物膜因高粘弹性难以通过机械刷牙清除，低渗透性则阻碍局部治疗药物渗透。

RESULTS AND DISCUSSION

Development of a novel technique for 3D-printing oral biofilms onto hydroxyapatite surfaces

通过改良藻酸盐基生物打印技术，实现了在羟基磷灰石表面的3D生物打印。关键改进包括：在生物墨水制备过程中直接加入藻酸盐；培养介质中添加0.1 M氯化钙维持凝胶结构；羟基磷灰石磁盘预浸氯化钙促进藻酸盐固化。打印后经5分钟凝胶化，磁盘被浸入液体培养基中培养43和67小时。

3D-printed oral biofilms support bacterial growth

43小时时生物墨水生物膜干重显著低于标准生物膜（≤66.6%），但67小时时无显著差异。菌落形成单位（CFU）在两组间无统计学差异，表明生物墨水能支持细菌存活和生长。早期干重差异可能与柠檬酸钠后处理有关，成熟生物膜因胞外基质增加而增强稳定性。

3D-printed oral biofilms deposit increased exopolysaccharide matrix

生物墨水生物膜的水溶性多糖（WSP）含量在43和67小时均显著高于标准组（约2倍）。碱溶性多糖（ASP）在67小时也显著更高。这两种多糖是生物膜结构凝聚和防护的关键，表明生物墨水生物膜具有更强的致病特性。藻酸盐对照组未检测到WSP/ASP，证实多糖来源于细菌代谢。

3D-printed oral biofilms acidify their environment

生物墨水生物膜在19和27小时pH下降较慢，但43小时后与标准生物膜均达到pH ~4.5。初期差异源于生物墨水细菌产酸被无菌培养基稀释，而标准组浮游菌同样贡献酸度。培养基更换后两者酸化能力趋同，证实生物墨水允许代谢废物交换。

3D-printed S. mutans form patterned oral biofilms

共聚焦显微镜显示：19小时标准生物膜微菌落大小形状不均且限于HA表面，而生物墨水组分布均匀且被胞外多糖包围。生物墨水微菌落球形度显著更高、表面积更大。67小时标准组微菌落融合成宏观簇，生物墨水组保持球形并径向扩大，胞外多糖分布更广泛。

3D-printed oral biofilm structure and mechanical properties mature over early time points

冷冻扫描电镜显示生物墨水水凝胶孔径在19小时从20 μm显著减小至3.5 μm。流变测试表明存储模量随频率增加而上升，凝胶化在15-20秒内快速完成。压缩测试显示杨氏模量在0-19小时显著增加（近2倍），表明基质交联密度和弹性储能能力提升。

MATERIALS AND METHODS

使用羟基磷灰石磁盘（直径0.25英寸）作为基质。变形链球菌UA159在TYE+1%葡萄糖培养基中培养至对数中期（OD₆₀₀ 1.24±0.341）。生物墨水含1.5%藻酸钠+1%蔗糖，交叉链接剂为0.1 M氯化钙。培养介质更换时间点为19、27、43、51小时。分析包括干重、CFU、pH、WSP/ASP（酚硫酸法）、共聚焦显微镜（SYTO 9和Alexa Fluor 647-葡聚糖染色）、冷冻电镜和流变学测试。

该技术为研究口腔生物膜的空间组织、药物渗透性和微生物相互作用提供了创新平台，未来可拓展至多物种生物膜、唾液模拟和生物反应器动态环境。