哥伦比亚肠杆菌目细菌中blaKPC-31与blaPAC-2的涌现与传播：微生物实验室面临的新挑战

　　本文深入探讨了哥伦比亚地区肠杆菌目细菌对头孢他啶/阿维巴坦（CZA）的新型耐药机制，重点关注blaKPC-31变异体和首次报道的质粒介导blaPAC-2基因的传播。研究揭示了这些耐药机制常导致表型检测（如Carba NP、mCIM和侧流免疫分析）假阴性，凸显了分子监测和精准诊断在感染控制与抗菌药物管理中的紧迫性。

　　

引言

碳青霉烯类耐药肠杆菌目（CRE）的流行已成为全球公共卫生挑战，其最常见的耐药机制是产碳青霉烯酶。在拉丁美洲国家，头孢他啶/阿维巴坦（CZA）是治疗CRE感染的重要选择。阿维巴坦能有效抑制Ambler分类中的A类、C类和部分D类β-内酰胺酶，但对B类金属β-内酰胺酶（MBL）如NDM、VIM或IMP无效。然而，全球范围内CZA耐药率正在上升，主要由KPC变异体的出现和MBL的增加驱动。KPC酶活性位点（Ω-loop）的突变，如破坏Arg164和Asp179之间的盐桥，会增强对头孢他啶的水解并降低阿维巴坦的结合，导致CZA耐药。此外，2010年在印度发现的bla_PAC-1基因（编码C类β-内酰胺酶）及其变异体bla_PAC-2的出现，为CZA耐药提供了新机制，且因其难以通过常规方法检测而构成诊断挑战。

材料与方法

研究在2021年9月至2024年9月期间，从哥伦比亚七个城市的20家医疗机构收集了68株经自动化方法鉴定为CZA耐药的肠杆菌目临床分离株。菌种包括肺炎克雷伯菌（n=46）、大肠杆菌（n=10）等。通过肉汤微量稀释（BMD）和E-test方法确认CZA耐药性，并使用表型试验（mCIM、Carba NP、侧流免疫分析）和qPCR（检测bla_KPC、bla_NDM、bla_VIM、bla_IMP和bla_OXA-48）评估碳青霉烯酶产生。对15株MBL基因阴性菌株进行全基因组测序（WGS），使用Illumina NextSeq 1000技术，并通过SPADES进行从头组装。基因组分析包括物种鉴定、多位点序列分型（MLST）、耐药基因确定（ResFinder和CARD）、荚膜分型（wzi基因）和质粒不相容群（Inc.）鉴定。通过接合实验评估bla_PAC-2的转移能力。

结果

在68株初始耐药菌株中，54株（79.4%）经确认对CZA耐药。其中，28株（51.9%）同时携带bla_NDM和bla_KPC，1株（1.8%）携带bla_KPC和bla_VIM，10株（18.5%）仅携带bla_NDM，8株（14.8%）仅携带bla_KPC，7株（13.0%）未检测到任何碳青霉烯酶基因。对这15株非MBL生产者进行WGS分析，发现6株（40.0%）携带bla_KPC-31，1株（6.7%）携带bla_KPC-33，1株（6.7%）携带bla_KPC-8，5株（33.3%）携带质粒介导的bla_PAC-2，2株（13.4%）同时携带bla_PAC-2和bla_KPC-2。值得注意的是，所有bla_PAC-2阳性菌株均来自卡利市的同一家医疗机构。

分子分型显示，肺炎克雷伯菌临床分离株涉及6种不同的序列类型（ST），包括ST45、ST147、ST107、ST39、ST2274和ST258；大肠杆菌涉及ST131和ST648；阴沟肠杆菌为ST564。这些谱系部分与先前报道的耐药菌株一致。

对bla_KPC-8和bla_KPC-31的基因组环境分析显示，它们与典型的Tn₄₄₀₁a结构相关，而bla_KPC-2位于Tn₆₄₅₄结构中。一株大肠杆菌（1103）属于高危克隆ST131-H30-Rx，同时携带bla_CTX-M-15和喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变（GyrA-83I和ParC-80I）。

最引人注目的发现是bla_PAC-2基因出现在五种不同的肠杆菌目物种中：肺炎克雷伯菌（n=3）、霍氏肠杆菌（n=1）、抗坏血酸克吕沃菌（n=1）、粘质沙雷菌（n=1）和阿氏肠杆菌（n=1）。后两个物种同时携带bla_KPC-2和bla_PAC-2。与bla_PAC-1相比，bla_PAC-2存在三个氨基酸替换（K44Q、E309A和N339K）。该基因位于一个9.3 Kb的IncQ质粒上，并在所有分析菌种中保守存在。接合实验成功地将该质粒从肺炎克雷伯菌（1381）、抗坏血酸克吕沃菌（1385）和霍氏肠杆菌（1387）转移至大肠杆菌J53^AziR受体，证明了其在不同宿主间传播的能力。

对该IncQ质粒的详细分析未发现其他耐药或毒力基因，仅包含与质粒复制相关的repA基因和允许接合转移的mob基因。与染色体上的bla_PAC-1环境（位于Tn₁₇₂₁样转座子中）相比，bla_PAC-2的基因环境无明显相似性，表明其通过IncQ质粒的获取并非由该转座子介导。然而，该IncQ质粒与在枸橼酸杆菌和气单胞菌属中发现的携带bla_KPC-2的质粒具有高度相似性。

药敏试验显示，仅产bla_PAC-2的菌株对所有碳青霉烯类药物敏感，但对头孢菌素和哌拉西林/他唑巴坦的敏感性可变。同时携带KPC变异体和PAC-2的菌株对亚胺培南/瑞莱巴坦和美罗培南/伐硼巴坦完全敏感。在表型检测中，bla_KPC-31菌株的Carba-NP和侧流免疫分析结果为阴性；bla_KPC-33对mCIM和Carba-NP呈阳性，但侧流免疫分析为阴性；bla_KPC-8虽为阳性，但条带显色较弱。此外，WGS还鉴定出与碳青霉烯耐药相关的孔蛋白OmpK36和OmpK37的非同义突变，以及主要存在于肺炎克雷伯菌中的DNA旋转酶GyrA（S83I）和拓扑异构酶IV ParC（S80I）突变，这些突变导致对氟喹诺酮类药物的获得性耐药。

讨论

CZA耐药菌株的出现和传播是一个重大的治疗关切，特别是在CRE高流行国家。本研究强调，哥伦比亚不同城市和菌种中的CZA耐药主要由KPC变异体（bla_KPC-31、bla_KPC-33和bla_KPC-8）以及头孢菌素酶基因bla_PAC-2介导。

自2020年CZA在哥伦比亚获批用于临床以来，已发现超过200种bla_KPC变异体。这些变异体大多源自全球最流行的bla_KPC-2和bla_KPC-3。不同的KPC变异体表现出差异性的酶学特性，导致对β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的交叉耐药模式不同。本研究首次在哥伦比亚报道了携带bla_KPC-8的大肠杆菌，该变异体此前主要在波多黎的肺炎克雷伯菌ST512和ST258中发现。

不同KPC变异体的药敏表型各异。大多数对CZA耐药且对头孢他啶的水解活性增强，而其他变异体则主要降低阿维巴坦的抑制。许多KPC变异体会出现对碳青霉烯类（尤其是亚胺培南和美罗培南）敏感性恢复的现象，这限制了Carba NP、mCIM和侧流免疫分析等表型方法的检测准确性。这些常用检测的假阴性结果会导致实验室无法识别耐药菌株，延误有效治疗的处方。此外，某些降低碳青霉烯亲和力的KPC突变在治疗过程中可能回复，导致碳青霉烯耐药性丢失。

bla_PAC-2基因的发现揭示了CZA耐药的新机制，其通过高度可移动的遗传元件（bla_PAC-2/IncQ）存在快速传播的风险。该耐药性在五种不同的肠杆菌目物种中被检测到，表明其具有活跃的传播和成功的种间移动能力。PAC-2头孢菌素酶对头孢菌素的水解活性可变，且能水解CZA和头孢洛扎/他唑巴坦等最后手段抗生素。由于其表型检测显示对碳青霉烯类敏感，微生物学鉴别的差异可能导致不适当的治疗选择，进而引发临床失败。

结论

本研究报道了KPC变异体和PAC-2头孢菌素酶在哥伦比亚多种 clinically relevant 肠杆菌目物种中的传播，两者均导致CZA耐药。这些耐药机制在哥伦比亚（一个抗菌药物耐药性热点地区）的出现和传播，对准确的微生物学检测和明智的治疗决策构成了重大挑战。加强获得先进诊断工具的机会和优先控制这些机制应成为抗菌药物管理计划以及感染预防和控制工作的关键目标。