通过点突变和结构突变构建具有极高2,3-丁二醇耐受性的酵母菌株及其耐受机制的部分解析

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Construction of yeast with extremely high 2,3-butanediol tolerance by introducing point and structural mutations and partial elucidation of the mechanism of 2,3-butanediol tolerance

　　本研究针对酿酒酵母对2,3-丁二醇(2,3-BDO)耐受性低的问题，通过构建新型诱变质粒pEWPMSM_Co，结合DNA点突变和结构突变技术，成功筛选出耐受性显著提升的突变株YPH499/Co58。该突变株在175 g/L 2,3-BDO条件下培养96小时的OD600值达到亲本菌株的122倍。转录组分析揭示蛋白酶体、过氧化物酶体、TCA循环等相关基因上调与耐受性密切相关，为微生物法高效生产2,3-BDO的工业化应用提供了关键技术支撑。

　　

在全球变暖和化石资源枯竭的背景下，利用微生物从可再生植物生物质中生产化学品已成为一种备受关注的可持续策略。其中，2,3-丁二醇（2,3-butanediol, 2,3-BDO）作为一种重要的平台化合物，在化工、燃料和材料等领域具有广泛应用。传统的2,3-BDO生产依赖于石油资源，面临价格高昂和环境污染等问题。因此，开发基于微生物的2,3-BDO生物制造技术具有重要战略意义。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种安全的工业微生物，被广泛用于多种化学品的生产。然而，酿酒酵母对2,3-BDO的耐受性较低，严重限制了其在高浓度2,3-BDO环境下的生产效率。尽管通过代谢工程手段已显著提升了2,3-BDO的产率，但耐受性不足仍是实现工业化高产的主要瓶颈。由于酵母的胁迫耐受性涉及大量非特异性基因的协同作用，通过单一基因改造难以有效提升耐受性。因此，需要开发能够全面调控基因表达的策略，从而获得具有高耐受性的菌株。

为解决这一问题，大阪都市大学的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了一项创新研究，通过引入DNA点突变和结构突变，成功构建了具有极高2,3-BDO耐受性的酵母菌株，并初步揭示了其耐受机制。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先，构建了组成型表达诱变质粒pEWPMSM_Co，用于替代原有的半乳糖诱导型表达系统，以提高突变效率并解除碳源限制；其次，通过引入缺乏校对功能的DNA聚合酶δ（POL3-D321A/E323A）诱导点突变，并利用CRISPR-Cas9系统靶向基因组中的δ序列引入结构突变；最后，通过逐步提高2,3-BDO浓度的适应性进化策略，从94个突变株中筛选出耐受性显著提升的菌株。转录组分析采用RNA测序技术，并结合GO富集分析揭示耐受性相关通路。

构建和筛选2,3-BDO耐受突变株

研究人员首先将诱变质粒pEWPMSM_Co导入亲本菌株YPH499中，获得YPH499/PMSM_Co。通过逐步提高培养基中2,3-BDO浓度（从50 g/L至210 g/L）进行适应性培养，最终筛选出94个在210 g/L 2,3-BDO条件下生长的突变株。初步高通量筛选显示，75个突变株在150 g/L 2,3-BDO条件下的生长优于亲本菌株。进一步评估其在有无2,3-BDO条件下的相对生长率后，最终选出四个耐受性尤为突出的突变株：YPH499/Co36、YPH499/Co40、YPH499/Co53和YPH499/Co58。

评估选定突变株的2,3-BDO胁迫耐受性

去除诱变质粒后，获得纯化突变株YPH499/CoX（X: 36, 40, 53, 58）。在无2,3-BDO条件下，这些突变株的生长速率约为亲本菌株的1.8倍。而在含有100 g/L、150 g/L和175 g/L 2,3-BDO的培养基中，突变株的生长显著优于亲本菌株。特别是YPH499/Co58，在175 g/L 2,3-BDO条件下培养96小时后的OD₆₀₀值达到亲本菌株的122倍，表现出极高的耐受性。

评估选定酵母的多重胁迫耐受性

研究还评估了这些突变株对其他胁迫条件（包括乙醇、高温和低pH）的耐受性。结果表明，YPH499/CoX突变株在乙醇（70 g/L）、高温（37°C）和低pH（pH 2.5）条件下均表现出比亲本菌株更高的生长能力。例如，YPH499/Co58在乙醇胁迫、热胁迫和低pH胁迫条件下的OD₆₀₀值分别达到亲本菌株的63倍、1.8倍和3.3倍。这说明通过2,3-BDO耐受性筛选获得的突变株同时增强了对多种胁迫的交叉耐受性。

转录组分析

为深入解析2,3-BDO耐受性的分子机制，研究人员对亲本菌株和四个突变株在100 g/L 2,3-BDO条件下培养48小时后的转录组进行了分析。结果显示，四个突变株中分别有1086、1123、1078和1237个基因表达上调，1195、1179、1165和1283个基因表达下调。进一步分析发现，782个基因在四个突变株中共同上调，861个基因共同下调。

GO富集分析表明，上调基因显著富集在蛋白酶体相关过程（如蛋白质分解代谢过程、蛋白酶体复合物）、过氧化物酶体功能（如脂肪酸分解代谢过程）以及能量代谢通路（如TCA循环、线粒体包膜）等类别。同时，与氧化还原酶活性相关的基因也普遍上调。相比之下，下调基因主要涉及极化生长位点、小分子代谢过程和细胞壁组成等类别。

研究表明，2,3-BDO高耐受性突变株中蛋白酶体相关基因（如PRE1、RAD23）的上调可能有助于清除胁迫条件下积累的变性蛋白，并促进DNA修复过程。过氧化物酶体功能增强可能通过激活脂肪酸β-氧化和线粒体呼吸，提供更多能量以应对胁迫。TCA循环和线粒体呼吸链相关基因（如COX基因）的上调进一步支持了能量代谢在耐受性中的关键作用。此外，氧化应激相关基因（如ZTA1、UGA2）的上调有助于缓解活性氧（ROS）积累导致的细胞损伤。

研究人员还发现，多个胁迫相关转录因子（如CUP2、GIS1、HAA1、HSF1、MSN2和YAP1）在突变株中表达显著上调，这可能是其获得多重胁迫耐受性的重要原因。值得注意的是，热休克蛋白（HSP）和蛋白质折叠相关基因的表达在突变株中普遍下调，这与蛋白酶体系统功能增强相呼应，表明细胞可能通过调整蛋白质质量控制策略来适应胁迫环境。

本研究成功构建了具有极高2,3-BDO耐受性的酵母菌株，其中YPH499/Co58在175 g/L 2,3-BDO条件下的生长能力达到亲本菌株的122倍，显著优于以往报道的耐受性水平。转录组分析揭示了蛋白酶体、过氧化物酶体、TCA循环、线粒体功能以及转录调控网络在2,3-BDO耐受性中的关键作用。此外，该研究开发的诱变技术不依赖特定碳源，可高效引入点突变和结构突变，为构建具有优良性状的工业酵母菌株提供了通用平台。这些发现不仅推动了2,3-BDO的可持续微生物生产，也为理解酵母的多重胁迫耐受机制提供了重要见解。