工程化改造反向剪接样位点增强线性RNA表达的新策略

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Engineering back-splicing-like sites for enhanced linear RNA expression

　　本研究针对外源基因在细胞中因形成circRNA而降低线性RNA表达效率的问题，通过突变反向剪接样（BSL）位点成功抑制了Luc基因衍生的circRNA形成，使线性mRNA表达水平显著提升。该发现为优化基因表达系统提供了新思路，对基因治疗和生物技术应用具有重要价值。

　　

在生物技术领域，高效表达外源基因一直是研究人员追求的目标。然而，传统方法如启动子优化、密码子优化等虽有一定效果，却往往忽略了一个潜在问题：外源基因进入细胞后可能通过反向剪接形成环状RNA（circRNA），与线性mRNA形成竞争关系，从而降低目标蛋白的表达效率。这一现象如同一个隐藏的"基因表达陷阱"，限制了外源基因的表达水平。

近日发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》的研究首次系统揭示外源基因在细胞中形成circRNA的分子机制，并创新性地提出通过工程化改造反向剪接样（BSL）位点来增强线性RNA表达的新策略。该研究以荧光素酶（Luc）基因为模型，在三种不同细胞系（HepG2、BmN和CIK细胞）中证实外源基因确实可通过BSL位点形成多种circRNA变体。

关键技术方法

研究团队采用多种分子生物学技术验证实验发现：通过逆转录PCR（RT-PCR）和桑格测序鉴定Luc基因衍生的circRNA；利用实时定量PCR（qPCR）分析线性RNA与circRNA的表达平衡；构建BSL位点突变体并通过双荧光素酶报告系统检测蛋白活性；使用杆状病毒表达系统验证突变效果；通过RNA干扰（RNAi）技术敲低circRNA形成相关蛋白基因。

外源基因在细胞中形成circRNA的验证

研究人员首先设计针对Luc基因的发散引物，在转染T7-Luc RNA的BmN细胞中检测到8种不同的Luc衍生circRNA（命名为circLuc_1至circLuc_8）。

通过逆转录滚环扩增（RT-RCA）和桑格测序进一步确认这些RNA分子的环状结构。免疫荧光实验显示circLuc_1主要分布在细胞质中。在HepG2和CIK细胞中的平行实验也得到一致结果，证明外源DNA或RNA进入细胞后均可发生环化。

线性RNA与circRNA形成的竞争关系

实时定量PCR分析显示，circLuc_1和circLuc_2的表达量相对较高，其中circLuc_1约占其对应mRNA的10%，而其他circRNA的表达量仅为mRNA的1/1000。时间进程实验表明，线性mRNA和circRNA的表达趋势相似，但mRNA的表达量始终显著高于circRNA。

BSL位点突变增强线性RNA表达

研究人员采用同义突变策略设计了四种BSL位点突变体（pIZT-Luc^mut_1、pIZT-Luc^mut_2、pIZT-Luc^mut1-2和pIZT-Luc^mut1-8），避免改变氨基酸序列。

转染实验表明，突变体细胞中circRNA形成效率显著降低，而线性mRNA表达水平明显上升。双荧光素酶报告实验显示，随着质粒浓度增加，BSL位点突变体的荧光素酶活性相应提高。

杆状病毒表达系统验证

研究团队进一步构建了重组杆状病毒载体，

通过PCR验证获得正确的重组杆粒（Bacmid）。

感染实验结果显示，与野生型相比，BSL位点突变的重组病毒感染的细胞中线性Luc RNA表达量显著增加，Western blotting检测也证实LUC蛋白表达水平明显提升。

降低circRNA形成促进线性RNA表达

通过RNA干扰技术敲低异质核核糖核蛋白Q（hnRNPQ）和DEAD盒多肽5异构体2（DDX5 isoform 2）基因表达，

发现circLuc_1的形成受到抑制，同时线性Luc mRNA表达水平上升，表明这些蛋白在circRNA形成中起关键作用。

研究结论与意义

本研究首次系统证明外源基因在细胞中可通过BSL位点形成circRNA，这种环化过程与线性RNA表达存在竞争关系。通过工程化改造BSL位点，可有效抑制circRNA形成，显著提升线性RNA和蛋白表达水平。这一发现为优化基因表达系统提供了新思路，对基因治疗、疫苗开发和生物制剂生产等领域具有重要应用价值。研究还提示，circRNA形成可能作为线性mRNA表达的负调控机制，为理解基因表达调控网络提供了新视角。

该研究的创新之处在于突破了传统基因表达优化策略的局限，从RNA剪接层面解决了外源基因表达效率低下的问题。未来，基于BSL位点设计的基因表达优化技术有望在生物医学领域发挥重要作用，为高效基因治疗载体的开发提供理论依据和技术支持。