毕赤酵母高效表达功能性人源唾液酸转移酶ST6GalNAc5/6及其在母乳寡糖合成中的应用

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Expression of functional human sialyltransferases ST6GalNAc5 and ST6GalNAc6 in Pichia pastoris

　　本研究成功在毕赤酵母中实现人源α-2,6-唾液酸转移酶ST6GalNAc5和ST6GalNAc6的功能性表达。通过构建(GGGS)2 linker优化分泌效率，结合MgCl2和Casamino acids培养基优化，使活性酶产量提升至10 mg/L。研究发现N-糖基化对酶活性与稳定性至关重要，为规模化合成抗坏死性小肠结肠炎关键组分DSLNT提供了新策略。

　　

在生命早期营养领域，母乳寡糖（HMOs）作为母乳中第三大固体成分，对新生儿肠道菌群定植和神经系统发育具有关键作用。其中唾液酸化HMOs占比达10-30%，而双唾液酸乳-N-四糖（DSLNT）更被证实能有效预防早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）——一种死亡率极高的肠道疾病。然而，DSLNT的规模化生产面临技术瓶颈，其生物合成关键酶——人源α-2,6-唾液酸转移酶ST6GalNAc5和ST6GalNAc6，由于具有复杂翻译后修饰特性，传统原核表达系统难以实现功能性表达。

为解决这一难题，丹麦技术大学与DSM-Firmenich联合团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表研究，首次报道在毕赤酵母中成功表达具有完整功能的人源ST6GalNAc5和ST6GalNAc6。研究人员通过AlphaFold2结构预测精准截断跨膜结构域，设计包含(GGGS)₂ linker的分泌型载体，并系统优化温度、甲醇诱导策略及培养基组分，最终使活性酶产量达到商业化生产水平。该研究不仅建立了高效的酵母表达平台，更深入揭示了N-糖基化对唾液酸转移酶结构与功能的关键调控作用。

关键技术方法包括：基于AlphaFold2模型的蛋白结构域设计、毕赤酵母X-33菌株的分泌表达优化、镍亲和层析纯化、纳米差示扫描荧光（NanoDSF）热稳定性分析、圆二色谱（CD）二级结构鉴定以及高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）对DSLNT产物的精确定量。

设计表达构建体

通过AlphaFold2模型分析发现ST6GalNAc5（72-336位氨基酸）和ST6GalNAc6（71-333位氨基酸）的N端存在低置信度区域。设计五种载体构建体，其中三种引入(GGGS)₂ linker连接α分泌因子与催化结构域。NetNGlyc 1.0预测显示两个酶各含两个N-糖基化位点（ST6GalNAc5: N137/N161；ST6GalNAc6: N98/N149），均位于唾液酸结合 motif L附近。

Mut+与Mut^S菌株表达比较

在20°C低温诱导条件下，X-33（Mut+）菌株分泌效率达45-50%，显著高于KM71H（Mut^S）。Western blot显示分泌蛋白分子量略大于理论值（32 kDa），提示存在酵母型糖基化。仅携带(GGGS)₂ linker的His6标签构建体（#3/#4）检测到DSLNT合成活性，而Strep II标签构建体虽表达量高但无活性。

镁离子与酪蛋白氨基酸优化

添加3 mM MgCl₂和1% Casamino acids使ST6GalNAc5分泌量提升3.8倍（10.3 mg/L），ST6GalNAc6提升4.8倍（9.2 mg/L）。但过量补充（3 mM MgCl₂+1% CA双次添加）会导致ST6GalNAc6失活，表明酶对培养基组分存在敏感性窗口。

酶学性质表征

NanoDSF分析显示野生型酶热稳定性优异（ST6GalNAc5 T_m=54.3°C；ST6GalNAc6 T_m=56.8°C）。在pH 7.0、37°C条件下，ST6GalNAc5对底物LST-a的K_m值（1.6 mM）显著低于ST6GalNAc6（6.7 mM），催化效率（k_cat/K_m）高出7.4倍。HPAEC-PAD证实产物为单一DSLNT异构体，无细菌表达系统中常见的副产物。

N-糖基化功能验证

Endo H和PNGase F处理证实酶携带高甘露糖型N-糖链。定点突变消除糖基化位点（ST6GalNAc5 N137Q/N161Q；ST6GalNAc6 N98Q/N149Q）导致酶活性丧失，CD光谱显示突变体α-螺旋含量增加、β-折叠减少，NanoDSF检测发现熔解温度降低7-22°C，证明糖基化对维持正确构象不可或缺。

本研究突破性地建立了毕赤酵母表达复杂糖基转移酶的技术范式，通过分子设计使活性酶产量达到应用级水平。特别值得注意的是，研究首次系统揭示ST6GalNAc亚族酶的活性严格依赖N-糖基化修饰，这一发现对真核蛋白表达策略具有普适性指导意义。所获得的高纯度酶制剂为DSLNT的酶法合成提供了稳定工具，有望推动母乳寡糖在婴幼儿营养与疾病预防领域的实际应用。该工作同时证明毕赤酵母在表达哺乳动物糖基化酶方面的独特优势，为其他难表达糖生物学工具酶的制备提供了新思路。