水生流式细胞术标准化实践：CytoSense在浮游植物群落分析中的优化与应用指南

《Cytometry Part A》：Best Practices for Optimization of Phytoplankton Analysis in Natural Waters Using CytoSense Flow Cytometers

　　本文系统综述了CytoSense型流式细胞仪在浮游植物分析中的标准化操作流程，重点阐述了仪器校准（如荧光微球稳定性监测、样本泵校准）、采集参数优化（触发阈值、PMT电压设置）及数据质量控制策略。通过对比不同型号仪器（如CS-2015-68与CS-2019-93）的性能差异，提出了兼顾微型（如原绿球藻RedPicoProk）与微型浮游植物检测的双协议方案，为构建可交互的浮游植物数据库（如FAIR原则）提供技术支撑，推动水生微生物生态学研究的标准化与数据可比性。

　　

仪器校准与质量控制

CytoSense流式细胞仪的标准化操作始于仪器校准。荧光微球（如1μm和3μm聚苯乙烯微球）的定期分析可监测光学稳定性，实验显示在赫尔辛基至特拉弗明德的渡轮部署中，微球的绿色荧光（FLG）和前向散射（FWS）信号分布保持稳定。若微球光学值异常，可能提示激光失准、流动室堵塞或液流速率变化，需及时检修。样本泵校准通过称重法或注射器体积测量验证，误差超过5%时需通过CytoUSB软件重新校准。此外，鞘液需添加防腐剂（如0.03%-0.1% Proclin）并定期更换，以防生物污损和盐结晶堵塞管路。

采集参数优化策略

计数速率与重合误差控制

高事件速率可能导致重合误差，即多个粒子同时通过检测区被误判为单一事件。稀释实验表明，当事件速率超过3300 events·s^-1（流速3μL·s^-1）时，CS-2015-68仪器的计数误差达10%。新型号（CS-2019-93）在5000 events·s^-1时仍无显著误差，建议利用CytoUSB的自动流速调节功能规避高风险样本。

触发阈值与PMT电压优化

触发阈值设置需平衡最小化“非浮游植物事件”与最大化目标细胞检测。以马赛湾水体为例，空白实验显示红色荧光（FLR）阈值≤6mV时仪器本底噪声显著，而FLR=7mV虽降低噪声但漏检红系超微型浮游生物（RedPicoProk）。PMT电压预设为“中”时，FLR阈值6mV可准确检测RedPicoProk（丰度7630±651 cells·mL^-1），而“高”电压虽提升灵敏度但易导致信号饱和。侧向散射（SWS）触发能完整记录大细胞脉冲形态，避免因色素分布不均导致的尺寸低估，但需以FLR触发优化为前提。

浮游植物群落分辨方案

针对浮游植物粒径跨度大（0.2-200μm）的特点，推荐双协议采集：低触发阈值（如FLR 1.25-6mV）结合小体积（0.3-1mL）靶向超微型浮游植物；高阈值结合大体积（5-10mL）及SWS触发用于稀有微型浮游植物，后者可借助脉冲形态图像校正链状细胞尺寸。实验表明，温度波动（18°C-35°C）可能影响光学信号，建议在温控环境下操作或进行数据校正。

标准化应用与数据互操作性

通过统一术语（如红系超微型浮游生物RedPicoProk、橙系超微型浮游生物OraPicoProk）和优化流程，可构建适用于自动化分类的训练集。微球信号标准化进一步支持荧光值向叶绿素a浓度或细胞尺寸的转化。该框架有助于实现浮游细胞功能性状数据库的FAIR化（可查找、可访问、可交互、可重用），为全球水生生态系统监测提供可靠工具。