掺锌（ZnO）膜在生物污损减缓方面的评估：标准微生物测试的局限性及对先进评估方法的需求

《Environmental Technology》：Evaluation of ZnO-doped membranes for biofouling mitigation: limitations of standard microbial tests and the need for advanced assessment

　　研究ZnO纳米颗粒掺杂双层膜的抗菌及抗污性能，发现传统培养法高估了抗菌效果，因部分细菌进入VBNC状态。通过荧光染色检测EPS蛋白，5% ZnO浓度时EPS减少84%，有效抑制生物膜形成。膜结构分析表明，过高ZnO浓度导致结构缺陷，影响性能。建议结合活死细胞分析及EPS评估以更准确评价膜材料。

　　膜过滤技术作为一种安全且可持续的水处理方法，被广泛应用于水和废水处理领域。其高污染物去除效率和选择性分离能力使其在各种处理规模中具有应用潜力。然而，膜污染问题仍是制约其广泛应用的主要障碍。细菌在进水侧迅速附着于膜表面，形成生物膜，不仅降低系统效率，还增加能耗。生物膜由细菌细胞嵌入稳定的胞外聚合物物质（EPS）基质组成，这种结构使得生物膜对物理和化学清洗具有较强的抗性。EPS的形成与群体感应（QS）密切相关，QS调控微生物在生物膜形成过程中的行为。因此，通过群体淬灭（QQ）方法，如引入具有QS干扰能力的微生物，可有效减少生物膜的形成。已有研究显示，通过引入QQ珠体，可使膜生物反应器（MBRs）的生物膜形成减少约3.4倍。

与此同时，金属和金属氧化物纳米颗粒（NPs），如银（Ag）、铜（Cu）、金（Au）、氧化锌（ZnO）、氧化铜（CuO）和二氧化钛（TiO?），因其强大的抗菌和抗污染特性而受到关注。这些NPs对微生物具有高毒性，因此在减少膜表面生物污染方面表现出色。因此，它们被广泛用于膜的改性研究，以提高膜性能并实现抗污染特性。特别是ZnO纳米颗粒，其抗菌机制通常被认为是通过释放Zn2?离子和活性氧物质（ROS）来诱导氧化应激或穿透细胞壁和内部结构。此外，当膜暴露于光源照射时，其抗菌活性会进一步增强，因此ZnO掺杂膜在光催化膜反应器中具有潜在应用价值。然而，目前尚无商用的光催化膜产品，这可能与对其性质的理解不足有关。

传统微生物学测试方法，如培养和计数技术，常用于膜抗污染特性的评估。然而，这些方法存在局限性，无法准确判断微生物是否被真正杀死，也无法准确估计总细胞数，或者区分那些失去形成菌落能力但仍参与生物膜形成和污染的微生物。因此，需要采用更先进的方法来评估和量化膜上的生物膜。基因分析方法，如分析生物膜中QS相关的基因，已被应用于此类研究，但其技术复杂且无法确定生物膜的活性。另一方面，一些常规方法可用于总生物膜的定量，以及特定成分如蛋白质或多糖的测定。然而，选择合适的方法至关重要，因为不同技术在复杂生物膜中的应用存在限制。例如，Lowry法虽然常用于蛋白质定量，但其在复杂生物膜中的应用受限于EPS和其他基质成分的干扰。

此外，抗菌性能评估通常使用特定菌株，如大肠杆菌（E. coli）或金黄色葡萄球菌（S. aureus）。然而，这些菌株并非膜系统的典型微生物，因为它们通常与人类或动物表面微生物群落相关，而非自然水处理系统中的微生物。因此，使用假单胞菌属（Pseudomonas spp.）或其他天然微生物群落作为测试微生物可能更符合实际应用需求。例如，假单胞菌属常见于饮用水输送系统和膜生物反应器中的生物膜。

本研究旨在通过制造不同浓度的ZnO纳米颗粒掺杂的双层混合基质膜，探讨纳米颗粒浓度对细菌生长的影响。采用培养方法和先进的技术来评估膜在光催化条件下的细菌活性，从而更深入地理解ZnO对微生物的影响。此外，通过适应的EPS评估方法，使用一种在实际过滤系统中常见的生物膜形成微生物来评估这些膜的抗生物膜形成潜力。尽管已有大量关于改性膜的研究，但关于这些系统中生物膜命运的信息仍显不足。

在本研究中，双层膜通过非溶剂诱导相分离（NIPS）技术制备，使用聚醚砜（PES）和N-甲基吡咯烷酮（NMP）作为基质材料，纳米颗粒的掺杂浓度为六种不同水平。这些膜在结构上保持了良好的不对称性，且未出现层间剥离现象。扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDX）分析显示，纳米颗粒在膜结构中分布不均，且在较高浓度下形成了较大的团聚体。这些团聚体可能影响膜的物理性能，例如增加膜的孔隙率和改变其渗透性。然而，过高的纳米颗粒负载量会导致膜溶液粘度增加，影响混合效果，从而导致膜表面出现缺陷，如贯穿孔洞，这限制了其实际应用。

在膜过滤性能测试中，观察到掺杂ZnO的膜表现出不同的渗透特性。其中，Zn 15和Zn 25膜的渗透率显著高于预期，这表明它们的表面结构存在缺陷。相比之下，纯PES膜和Zn 1至Zn 10膜在过滤过程中表现出正常的渗透行为。然而，这些膜的渗透率下降幅度不如之前的研究中所见，这可能与膜改性的具体方法有关。在本研究中，纳米颗粒的掺杂未涉及额外的处理步骤，因此其对膜性能的影响可能与以往研究不同。

通过分析膜的孔隙率和分子量截留值（MWCO），发现纳米颗粒的掺杂对膜的孔隙率影响较小，但对MWCO产生了非线性变化。例如，Zn 1膜表现出最高的MWCO（41±7 kDa），而随着纳米颗粒浓度的增加，MWCO逐渐降低，最终在10%浓度时接近纯PES膜的MWCO（20±3 kDa）。这一结果表明，虽然低浓度的纳米颗粒可能增加膜的孔隙率，但高浓度则可能导致膜结构的致密化，从而降低其分子量截留能力。

为了更准确地评估膜的抗菌性能，本研究采用培养法和荧光显微镜下的细胞活性测试。培养法显示，所有ZnO掺杂膜在24小时后对E. coli的灭活率均高于纯PES膜，其中Zn 2.5至Zn 25膜的灭活率达到了约5 log（>99.999%）。然而，荧光显微镜下的活性测试表明，尽管灭活率高，但仍有大量细胞存活，甚至形成微菌落。这表明培养法可能高估了膜的抗菌效果，而微菌落的存在可能使CFU计数结果失真。因此，传统培养法在评估膜的抗菌性能时可能并不准确，而需要结合更先进的方法，如细胞活性检测，来全面评估微生物的生存状态和膜的抗污染能力。

在评估生物膜形成时，使用了SYPRO Ruby荧光染色法来检测EPS蛋白。由于直接在PES膜上进行染色会导致较高的背景荧光，因此采用间接方法，将膜样品置于微孔板中，使用染色液染色微孔板底部，而不是膜表面。这一方法可以更准确地检测EPS蛋白，从而评估生物膜的形成情况。结果表明，Zn 5膜对P. aeruginosa的EPS蛋白产量减少了84%，而Zn 1膜的EPS蛋白产量减少了44%。这说明ZnO纳米颗粒对生物膜形成具有显著抑制作用，尤其是在EPS的合成方面。然而，某些ZnO掺杂膜（如Zn 10至Zn 25）的EPS蛋白产量反而增加，这可能与膜表面的物理特性变化有关，例如纳米颗粒的团聚可能改变了膜表面的抗菌活性，进而影响微生物的EPS合成。

本研究还强调了选择合适测试微生物的重要性。由于E. coli和S. aureus并非膜系统中的典型微生物，因此使用P. aeruginosa作为测试微生物更符合实际应用场景。此外，本研究还指出，培养法在评估膜的抗菌性能时存在局限性，可能无法准确反映微生物的真实状态。因此，建议结合培养法和细胞活性检测，以更全面地评估膜的抗菌性能和生物膜形成情况。

总之，本研究展示了ZnO掺杂双层膜在水处理中的潜力，特别是在减少生物污染方面。然而，也指出了当前研究中的局限性，如纳米颗粒的负载量和膜结构的影响，以及测试微生物的选择对结果的重要性。未来的研究需要进一步优化膜的制备方法，减少纳米颗粒的浪费，并提高测试方法的准确性和可靠性，以推动这些新型膜材料在实际工业应用中的发展。