肠道菌群对糖尿病肾病的因果影响：16S rRNA测序与双向孟德尔随机化研究的深入解析

《Renal Failure》：Causal effects of gut microbiota on diabetic kidney disease: insights from 16S rRNA sequencing and bidirectional Mendelian randomization

　　本综述通过整合16S rRNA测序与双向孟德尔随机化（MR）分析，系统阐明了肠道菌群失调与糖尿病肾病（DKD）发生发展的因果关联。研究首次鉴定出10个关键细菌属（如有害菌Barnesiella、Butyricimonas与保护菌Slackia、Allisonella）对DKD进展的因果效应（OR值1.278-2.518，p<0.05），并揭示DKD严重程度反向调控Ruminococcus2等菌属丰度的双向互作机制。这些发现为DKD的早期生物标志物挖掘和微生态靶向治疗提供了新视角。

　　

引言

糖尿病肾病（DKD）作为糖尿病主要微血管并发症，以蛋白尿或估算肾小球滤过率（eGFR）下降为特征。尽管血糖控制手段不断进步，但DKD进展仍存在显著的个体差异，提示非血糖因素如肠道菌群失调可能参与其中。肠道微生物组包含超过100万亿微生物细胞，关键调控宿主代谢、免疫功能和黏膜完整性。在DKD中，肠道菌群可能通过改变内分泌信号和微生物代谢物（如短链脂肪酸、尿毒症毒素）影响疾病进展；反之，高血糖和肾功能下降可能加剧菌群失调，形成潜在反馈循环。虽然观察性研究报告了DKD患者与对照之间的微生物差异，但关键知识空白依然存在：这些改变是DKD的因果驱动因素还是继发后果？哪些特定分类群对疾病进展发挥双向效应？解决这些问题需要因果推断方法，如孟德尔随机化（MR），以超越相关性揭示微生物组-DKD相互作用。

方法

横断面研究

参与者招募与伦理考量：本研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院研究伦理委员会批准。2019年6月至2020年2月，从瑞金医院肾脏科招募46例临床诊断的2型DKD患者。纳入标准包括：年龄18-90岁；临床诊断为2型糖尿病（T2D）和DKD（基于白蛋白尿或eGFR<60 mL/min/1.73 m²）；无严重合并症。排除标准包括：提示其他肾脏疾病病因的特征；样本收集前3个月内使用抗生素或益生菌补充剂。最终44例患者纳入分析，根据24小时尿蛋白（24-h UPro）和eGFR分为早期和晚期DKD组（早期组：24-h UPro ≤500 mg/24 h，eGFR ≥45 mL/min/1.73 m²；晚期组：24-h UPro >500 mg/24 h或eGFR <45 mL/min/1.73 m²）。此外，定义DKD易感组（从DM发病到晚期DKD病程<10年或肌酐倍增/1年内进展至CKD5期）和DKD抵抗组（早期DKD且DM病程>10年）。

临床数据收集：通过直接访谈收集临床数据。高血压定义为SBP≥140 mmHg和/或DBP≥90 mmHg，或有高血压病史或使用降压药物。生化检测和粪便收集在入组时进行。eGFR使用2012年CKD-EPI肌酐公式计算。CKD分期基于eGFR。

样本收集与DNA提取：参与者早晨提供粪便样本，-80°C保存。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取总粪便DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计定量基因组DNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA完整性和大小。

16S rRNA基因扩增与测序：使用通用引物（341F和806R）扩增16S rRNA基因V3-V4区。扩增子在Illumina Miseq平台上测序，产生300-bp双端读长。所有样本共获得5,277,034条清洁读长，平均每个样本119,932.6±5,995.8条清洁标签（测序深度）。为标准化比较，每个样本随机选择67,914个标签进行后续分析。

统计分析：使用SPSS（版本25.0）和R软件（版本3.1.0）进行统计分析。组间比较使用Student t检验（定量变量）和Pearson卡方检验（分类变量）。使用广义线性模型（GLMs）评估患病率≥10%的属与不同组临床参数之间的关联，使用R包‘glmmTMB’，根据目标变量分布采用负二项分布。使用Spearman等级相关分析（R包‘cor.test’）计算44例DKD患者DKD临床参数与患病率≥10%的属之间的相关性。使用方差膨胀因子（VIF）检验变量共线性（VIF>5视为共线性）。使用五折交叉验证LASSO（R包‘glmnet’）选择潜在混杂因素。使用GLMs评估与混杂因素显著相关的属（Spearman相关性p<0.05）。

孟德尔随机化研究

数据来源：从MiBioGen联盟获取肠道微生物组GWAS汇总数据（18,340名参与者，主要为欧洲裔）。该GWAS数据包含211个细菌群，本研究聚焦于属水平（共131个属）。将横断面研究中具有临床意义的细菌属纳入MR分析。糖尿病肾病结局特征采用ICD-10标准（N08.3*），汇总统计数据来自FinnGen生物库（184,987名欧洲个体，3,283例病例和181,704例对照）。还收集了先前研究中糖尿病患者肾小球滤过率（GFR）的汇总数据（11,522名欧洲裔参与者）。鉴于横断面研究为2型DKD患者，从先前研究中提取2型糖尿病（T2D）中DKD的GWAS数据，使用八种互补的二分类和定量DKD表型。

SNP选择与统计分析：采用逆方差加权（IVW）法进行MR分析。SNP选择遵循MR三个核心假设：相关性（SNP与暴露强相关）、独立性（SNP独立于混杂因素）、排他性限制（SNP仅通过暴露影响结局）。具体而言，SNP基于显著性阈值（p<1×10^-5）识别。排除连锁不平衡的SNP（r²<0.01，聚类距离500 kb）。使用PhenoScanner数据库识别并排除潜在多效性SNP。排除F统计量<10的弱工具变量。每次MR分析前采用MR-PRESSO方法剔除潜在异常值。保留的SNP用于后续分析。使用MR-Egger、加权中位数、加权模式和简单模型等替代方法验证结果。使用Cochran Q检验评估异质性，通过MR-Egger截距检验评估多效性。进行留一法敏感性分析评估单个SNP对结果的影响。所有统计分析使用R软件（版本4.3.0）进行。

结果

晚期与早期DKD组特征

两组在年龄、性别、便秘率、DM病程、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）或高血压患病率方面无显著差异。然而，与早期组相比，晚期组DM发病年龄更大、DKD病程更长、SBP和24小时尿蛋白水平更高、从DM发病到肾损伤时间更短、eGFR更低、CKD分期更晚。

组间分类群改变

晚期与早期DKD组之间以及DKD易感与抵抗组之间，基于操作分类单元（OTU）水平的平均粪便微生物群落多样性指数（即α-多样性，包括chao1、observed species、PD whole tree、Shannon和Simpson）无显著差异。基于未加权和加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）图显示比较组间无显著分离（Adonis p>0.05），表明整体粪便微生物结构相似。

使用线性判别分析效应大小（LEfSe）分析进行组间微生物群的监督比较。在属水平上，与早期DKD患者相比，晚期DKD患者的Butyricimonas、Fusicatenibacter和Barnesiella相对丰度较高，而Allisonella相对丰度较低（LDA得分（log10）>2）。在DKD易感患者中，与抵抗患者相比，Fusobacterium相对丰度较高，而Allisonella和Eubacterium相对丰度较低（LDA得分（log10）>2）。

GLMs分析显示，晚期组和早期组的粪便样本与Olsenella、Barnesiella、Butyricimonas、Granulicatella、Desulfovibrio、Eggerthella、Slackia、Saccharibacteria genera incertae sedis、Eubacterium、Flavonifractor、Acidaminococcus、Phascolarctobacterium和Pseudomonas等属相关（p<0.05）。DKD易感组和抵抗组的粪便样本与Barnesiella、Gemella、Streptococcus、Holdemanella、Fusobacterium、Sphingomonas、Hemophilus、Eggerthella、Eubacterium和Akkermansia等属相关（p<0.05）。

粪便微生物群与DKD临床特征的相关性

研究发现粪便微生物群（属水平，患病率≥10%）与DKD各种临床参数（包括年龄、病程、血糖控制、DKD严重程度）之间存在关联。大多数已识别的粪便微生物群属与年龄呈负相关。相反，大多数已识别的属与从DM到肾损伤的较长病程、较差的血糖控制、蛋白尿增加和肾功能改善呈正相关。

在通过Spearman分析在DKD患者中与临床特征显著相关的32个分类群中（p<0.05），属Barnesiella、Allisonella和Fusobacterium通过LEfSe分析在比较组间存在显著差异。通过负二项GLMs分析，属Slackia、Acidaminococcus、Eggerthella和Eubacterium与早期DKD相关，后两个也与DKD抵抗相关。属Streptococcus、Fusobacterium、Hemophilus和Barnesiella与DKD易感性相关，最后一个也与晚期DKD相关。

经GLMs调整后，属Bradyrhizobium和Bilophila仍与年龄相关。属Rothia和Allisonella仍与FBG相关。属Bacteroides和Butyricicoccus保持与24-h UPro水平相关。属Parabacteroides保持与eGFR相关。

细菌属对DKD的影响

为阐明肠道微生物组丰度（涵盖研究中44个具有临床意义的细菌属）对DKD表型的影响，进行了两样本MR检验。

IVW分析揭示了14个细菌属与DKD表型相关。IVW估计表明，属Barnesiella、Butyricimonas、Desulfovibrio、Hemophilus、Bacteroides、Streptococcus、Flavonifractor和Phascolarctobacterium对DKD产生有害影响。前七个属与DKD发病或更严重DKD表型呈正相关，最后一个与T2D中eGFR呈负相关（Beta±SE: -6.813±2.626, p=0.009）。相反，属Slackia、Allisonella、Anaerostipes和Bilophila对DKD表现出保护作用。前三个与糖尿病患者GFR呈正相关，最后一个属与T2D中微量白蛋白尿呈负相关（Beta±SE: -0.653±0.311, p=0.036）。然而，Ruminococcus1和Fusicatenibacter对DKD表现出矛盾效应。留一法敏感性分析的散点图和森林图显示了这些效应估计值在不同MR方法和SNP中的一致性。Cochran IVW Q检验和MR-Egger回归截距分析显示这些工具变量无显著异质性或无显著方向性水平多效性。MR-PRESSO分析未识别出任何SNP异常值。这些敏感性分析证实了观察到的因果关系的稳健性。

DKD对细菌属的影响（反向MR）

反向MR分析表明，对更严重DKD表型的遗传易感性因果性地增加了Ruminococcus2的丰度，同时因果性地降低了Allisonella和Akkermansia的丰度。敏感性分析（MR-Egger截距、留一法）证实了这些反向因果效应的稳健性。

讨论

本研究证实了肠道菌群失调与DKD进展之间的关联。使用预测模型和MR识别并确认了多个细菌属与DKD的因果关系。研究确定了44个与DKD临床参数相关的细菌属，其中29个与肾损伤特征（如早期或晚期、易感性、CKD分期、24-h UPro和eGFR）相关。这表明肠道菌群从DKD发病到进展动态变化，这些29个属可能促进DKD发病和恶化。研究确定了其中10个属与DKD存在因果关联，其中大多数在先前研究中被忽视。

晚期DKD的表型定义（24-h UPro >500 mg/24 h或eGFR <45 mL/min/1.73 m²）基于既定的KDIGO指南。eGFR阈值<45 mL/min/1.73 m²对应CKD分期G3b，KDIGO因其进展和合并症风险升高而区分；24-h UPro阈值>500 mg/24 h符合KDIGO白蛋白尿类别A3（ACR≥300 mg/g），指示严重白蛋白尿和高风险DKD进展。这些标准在预后研究中广泛采用以分层DKD严重程度。对于DKD易感性定义（从DM发病到晚期DKD病程<10年），参考了将较短糖尿病病程与加速肾功能下降相关联的流行病学研究。虽然对该特定阈值的共识仍然有限，但其使用有助于与显示快速进展表型的队列进行比较。

研究发现Bacteroidota门的Bacteroides、Barnesiella和Butyricimonas属与严重DKD表型呈正相关，MR分析结果显示它们是加重DKD的原因。Bacteroides物种可通过微生物二肽基肽酶4降解宿主胰高血糖素样肽-1活性，并产生吲哚，转化为硫酸吲哚酚。Barnesiella物种参与碳水化合物发酵和免疫调节，在DN组中更丰富。Butyricimonas以产生短链脂肪酸（SCFAs）闻名，在DKD患者肠道中富集。Desulfovibrio和Hemophilus（曾属于Proteobacteria门，现分别重新分类为Thermodesulfobacteria门和Pseudomonas门）在肠道微生物失调中发挥作用，影响宿主代谢和免疫紊乱、炎症和营养状况。研究显示它们的水平在晚期和易感个体中升高，并在DKD恶化中发挥作用。Desulfovibrio导致肠道屏障丧失并促进炎症，而Hemophilus以其致病性闻名。Streptococcus和Ruminococcus2（均属于Bacillota门）具有 contrasting 特征。Streptococcus促进DKD进展，但并非所有物种都是致病性的。许多是人类微生物组的组成部分。Ruminococcus2被本研究通过MR鉴定为由蛋白尿诱导，在结肠中降解抗性淀粉，并与多种疾病相关，作为炎症标志物。Slackia、Allisonella和Akkermansia与较轻DKD相关，与DKD存在因果关系。Slackia产生多酚和生物活性代谢物，有益于肾脏疾病治疗。Allisonella从组氨酸产生组胺，在高血压小鼠模型、严重心肾损伤大鼠模型、抗肾小球基底膜抗体诱导肾小球肾炎大鼠模型以及急性A型主动脉夹层患者术后急性肾损伤中具有肾脏保护作用。Akkermansia是一种益生菌，改善肠道屏障完整性并产生丁酸盐。总之，随着DKD恶化，有益微生物减少，有害微生物增加。

研究结果暗示这些微生物特征的具体临床效用。强调某些微生物属，如Barnesiella、Butyricimonas和Desulfovibrio，由于其与疾病严重程度的因果关联，可作为DKD进展的早期生物标志物。相反，保护性属如Slackia、Allisonella和Akkermansia可能代表有希望的治疗靶点。例如，靶向这些有益类群的益生菌或调节其代谢物（如SCFAs）的干预措施可能潜在地减缓DKD进展。这些见解与微生物组为基础的诊断和治疗新兴策略一致，值得进一步临床验证。

尽管有全球研究，但DKD的一致关键细菌集合仍不清楚。一项包含16项研究（578例DKD患者和444例健康对照）的荟萃分析显示，与健康对照相比，DKD患者细菌丰富度显著降低，但多样性指数无显著差异。值得注意的是，先前的观察性研究主要对比DKD患者与健康对照，识别出Faecalibacterium和Roseburia的耗竭以及致病性Enterobacteriaceae和Desulfovibrio的富集。然而，此类比较可能混淆糖尿病相关微生物变化与DKD特异性改变。

与这些研究不同，研究使用早期或抵抗性DKD患者作为对照而非健康个体。结果显示DKD患者组间粪便微生物群的α-多样性指数（丰富度和多样性）和β-多样性指数（结构）无显著差异。这与DKD与健康队列中微生物丰富度降低的报道形成对比，表明分类群特异性动态——而非整体多样性——驱动DKD进展。例如，虽然Bacteroides和Streptococcus在晚期DKD队列中富集，但它们的因果作用通过MR得到进一步验证，解决了基于相关性的观察性研究的局限性。相反，保护性属如Allisonella和Slackia（在先前荟萃分析中被忽视）作为保留肾功能的新生物标志物出现。

本研究是首个调查肠道微生物组与DKD之间遗传因果关系的MR分析。使用最大的肠道微生物组GWAS，为支持特定肠道微生物组改变在DKD发病机制中的作用提供了有力证据。虽然随机对照试验（RCTs）是建立因果关系的金标准，但由于肠道微生物物种的巨大多样性以及从肠道微生物组失衡到DKD发展的长潜伏期，其应用具有挑战性。

研究有几个局限性。作为横断面单中心研究，小样本量的发现需要在更大、多中心人群中验证。其次，虽然大多数患者服用降糖或降压药物，但T2D人群的先前RCTs（如达格列净/格列齐特）表明这些药物对粪便微生物组组成的短期影响最小。第三，虽然16S rRNA测序提供分类学见解，但其分辨率限制了物种水平和功能解释。未来整合鸟枪法宏基因组学和代谢组学可以阐明微生物途径并识别DKD进展中的因果代谢物。多组学方法将增强生物标志物发现和治疗靶向。最后，肠道微生物组成的种族差异（如西方队列中Bacteroides主导与东亚人群中Prevotella富集）和遗传适应（如饮食相关多态性）可能引入跨种族MR偏倚。人群特异性GWAS和多民族验证对于提高普适性至关重要。

结论

研究揭示了肠道菌群失调与DKD进展和易感性之间的因果关系。确定了几个影响DKD的细菌属，暗示了解决这种疾病的潜在治疗靶点。此外，确定了几个受DKD影响的细菌属，可能作为DKD进展和易感性的生物标志物。DKD中肠道菌群失调的证据在不同研究中似乎相当一致，尽管与DKD相关的分类群在全球研究中有所不同。这些差异可能增强对DKD发病机制的理解，并可能支持旨在修改DKD患者肠道微生物组的潜在新治疗选择。这些发现为减缓DKD进展的微生物组靶向干预奠定了基础。