噬菌体编码生物膜分散因子在大肠杆菌中的粗提制备及其在环境水样细菌学分析中的应用潜力

《Applied and Environmental Microbiology》：Crude preparation of a phage-encoded biofilm-dispersing factor expressed in E. coli and its potential application in bacteriological analysis of environmental water samples

　　本文报道了从霍乱弧菌噬菌体JSF7中克隆表达生物膜分散基因（ORF30）的创新研究。该基因在大肠杆菌DH5α中表达后，其粗提物能有效分散多种病原菌（如霍乱弧菌O1、痢疾志贺菌、铜绿假单胞菌）的生物膜，并在37°C、pH 7.0条件下保持活性。研究进一步证明，将粗提物加入富集培养基可显著提升环境水样中霍乱弧菌O1的检出率，为水传病原菌的监测提供了新技术策略。

　　

摘要

检测水生环境中病原菌的一个基本技术挑战是无法准确估算水中与生物膜相关的细菌。考虑到生物膜在细菌病原体的环境持久性和水传播中的作用，人们对能够有效降解细菌生物膜的物质越来越感兴趣。通过对具有生物膜分散能力的霍乱弧菌噬菌体JSF7进行全基因组测序分析，发现其携带一个预测编码复杂多糖降解酶的基因。该基因被克隆到大肠杆菌DH5α中，重组大肠杆菌的粗提物增强了多种细菌生物膜的分散，包括大肠杆菌、痢疾志贺菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌。该粗提物在37°C温度和pH 7.0条件下完全具有活性，但可被蛋白酶K处理灭活。通过富集培养法对环境水样中霍乱弧菌O1的存在进行分析发现，当富集培养基补充该粗提物时，检测到的霍乱弧菌O1阳性样品数量显著多于不使用粗提物的典型富集方法。这些结果表明，在大肠杆菌中表达的噬菌体编码生物膜降解因子的粗提物在降解细菌生物膜和增强水的细菌学分析方面具有潜在应用价值。

重要性

在其水生环境中，细菌通常以生物膜形式存在，难以通过培养水样准确检测。此类生物膜与水传病原菌的传播有关。我们鉴定了一种能够分解生物膜并分散生物膜相关细菌的噬菌体。将负责该活性的推定噬菌体基因克隆到大肠杆菌菌株中，发现重组大肠杆菌的粗细胞提取物能促进多种细菌生物膜的分散。在细菌生长培养基中添加粗提物也增强了对环境水样中霍乱弧菌O1（霍乱的病原体）的检测。噬菌体衍生的生物膜降解因子分散多种细菌生物膜的能力为增强传统富集方法之外的水传细菌病原体检测提供了一种新方法。

引言

细菌生物膜是医疗和工业环境中感染和微生物污染的重要来源，也增强了病原体的水传播。生物膜是附着在表面的细菌群落，嵌入在通常由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成的复杂胞外聚合物基质中。生物膜中的病原菌通常表现出增强的抗菌药物耐药性。这些细菌因此难以消除，并可能成为病原体的持续来源。

在水生环境中，病原菌常以生物膜形式存在，其传播因聚集结构而促进，这种结构可将高剂量的病原体传递给潜在宿主。例如，可引起霍乱流行的产毒霍乱弧菌在水生环境中主要以生物膜形式存在并感染人类。鉴于观察结果表明生物膜是持续感染和水传细菌病原体传播的重要来源，也是逃避抗菌治疗的一种手段，人们对能够降解细菌生物膜的酶越来越感兴趣。此类酶也可能通过分散生物膜相关细菌来改善环境水样中细菌病原体的检测。我们先前鉴定了一种命名为JSF7的霍乱弧菌O1特异性噬菌体，它可以作用于生物膜并分散生物膜相关的细菌细胞。在本研究中，我们将JSF7噬菌体编码的生物膜分散因子克隆并表达在大肠杆菌中，并证明来自重组克隆的粗提物可用于降解多种细菌生物膜，以及增强环境水样的微生物学分析以检测致病性霍乱弧菌。

材料与方法

噬菌体和菌株培养

本研究用于噬菌体增殖和生物膜测定的细菌菌株来自icddr,b的菌种保藏中心。微生物菌株、质粒、遗传构建体和本研究中使用的噬菌体的描述见表1。常规使用LB肉汤或LB琼脂平板培养各种细菌菌株。在适用的情况下，使用选择性培养基，包括麦康凯琼脂、亚碲酸盐牛磺胆酸明胶琼脂（TTGA）或假单胞菌琼脂平板分别选择性生长大肠杆菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌。生物膜降解噬菌体JSF7最初如先前所述从孟加拉国的环境水样中分离得到。为常规扩增噬菌体，将霍乱弧菌O1宿主菌株C6706在LB中培养过夜16小时，用新鲜LB稀释100倍，并在37°C培养4小时。将来自单个噬菌斑的噬菌体样品加入细菌培养物中，并在37°C孵育16小时。以10,000×g离心20分钟后获得的上清液通过使用0.22微米孔径过滤器过滤去除细菌。通过软琼脂覆盖法测定过滤上清液中的噬菌体颗粒数。

JSF7噬菌体DNA的分离

通过将上清液与四分之一体积的PEG-NaCl溶液（20%聚乙二醇，PEG-6000，和10% NaCl）混合离心，从过滤除菌的培养上清液中沉淀噬菌体颗粒。将噬菌体沉淀重悬于含有20 mM Tris-Cl（pH 7.5）、10 mM MgCl、60 mM KCl和10 mM NaCl的缓冲液中。为去除外源DNA和RNA，将该溶液用DNA酶I（100单位/mL）和RNA酶A（50 μg/mL）在37°C处理2小时。然后通过酚-氯仿抽提破坏噬菌体颗粒，并使用乙醇沉淀DNA。将DNA溶解在去离子水中，并使用Promega DNA纯化系统进一步纯化。

噬菌体基因组分析

使用基于Illumina的技术对噬菌体基因组进行测序。简而言之，使用Illumina Nextera XT DNA文库制备试剂盒按照制造商的说明制备文库。使用Illumina MiSeq系统进行测序，并使用Illumina BaseSpace上提供的在线软件将序列组装成重叠群并与参考序列比对。JSF7噬菌体的基因组序列已存入GenBank，登录号为KY065149。

噬菌体基因在大肠杆菌中的克隆

使用标准分子方法克隆JSF7噬菌体预测编码推定生物膜降解因子的基因。简而言之，使用引物GCGTCGGCTTTAAGTGTTGT和GAAGCAACAGGTGCGGTTAT通过PCR扩增JSF7噬菌体基因组中编码推定多糖降解酶的ORF30。使用pGEM-T Easy Vector Systems将扩增产物克隆以构建pNSF18，然后将其导入感受态大肠杆菌DH5α细胞中。在含有氨苄青霉素（50 μg/mL）、0.1 mM IPTG和X-Gal（50 μg/mL）的LB琼脂平板上于37°C生长16小时后，通过蓝白斑筛选选择重组子。挑选可疑的重组菌落并进一步分析以确认重组质粒的存在。随后，通过SDS-PAGE分析大肠杆菌DH5α（pNSF18）和携带空载体的大肠杆菌DH5α的总蛋白提取物，以观察重组菌株中是否有任何新蛋白表达。

SDS-PAGE分析

将含有pNSF18或空载体的转化后大肠杆菌DH5α在LB中于37°C振荡培养至细胞密度达到OD₆₀₀为0.8。向培养物中加入IPTG至终浓度为1 mM，并在37°C继续孵育12小时。然后，将1 mL培养物以10,000 × g离心5分钟沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于250 μL蒸馏水中，并加入等体积的2× SDS上样缓冲液。将悬浮液在95°C加热10分钟，涡旋混合，并离心分离不溶性细胞碎片和可溶性蛋白。将含有可溶性蛋白的上清液等分上样到12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，并进行电泳。用考马斯亮蓝R-250溶液染色观察蛋白条带。

粗细胞提取物的制备

如上所述在含有IPTG的LB中培养细菌细胞，将15 mL培养物以10,000 × g离心5分钟收集细胞沉淀。使用由50 mM Tris（pH 7.4）、300 mM NaCl、10 μM亮抑酶肽、1 mM PMSF、抑肽酶（2 μg/mL）和胃蛋白酶抑制剂（10 μg/mL）组成的裂解缓冲液在冰上裂解细胞。将细胞裂解物在10 mM Tris-Cl，pH 7.4中于4°C透析12小时，每2小时更换透析液，共五次。将透析后的提取物作为生物膜降解因子的粗提物储存。使用霍乱弧菌C6706菌株的生物膜初步测试该粗提物的系列稀释液的生物膜降解活性。当使用储存液的10倍稀释液时，霍乱弧菌C6706生物膜在3小时内分散约50%（观察到570 nm吸光度降低）。随后，在所有测定中使用储存液的10倍稀释液作为工作稀释液。

生物膜的制备和估算

使用适当细菌菌株在硼硅酸盐玻璃管内表面形成生物膜。简而言之，挑取在LB琼脂平板上生长的细菌菌落，悬浮在LB肉汤中，使600 nm处光密度为0.6。将细菌悬浮液等分样品用LB稀释100倍后接种到多个硼硅酸盐玻璃管中，并将这些培养物在室温静置36小时以形成生物膜。使用结晶紫染色法估算生物膜，其中用蒸馏水冲洗含有生物膜的试管以去除未附着的细胞，然后加入1 mL 0.1%结晶紫溶液。30分钟后，再次用水冲洗试管以去除未附着的染料。加入1 mL二甲基亚砜（DMSO）以提取试管中生物膜相关的结晶紫染料。为估算生物膜，读取所得悬浮液在570 nm处的光密度，并按先前描述的方法解读读数。

生物膜分散活性测定

为估算大肠杆菌DH5α（pNSF18）细胞提取物的生物膜分散能力，将如上所述制备的生物膜暴露于该提取物，并检查生物膜的降解以及由于游离细胞释放导致的细胞计数增加。使用适当菌株在一系列玻璃管中产生生物膜。洗去游离细胞，保留内表面附着有生物膜的试管。将试管中的生物膜与1 mL在PBS（pH 7.0）中稀释10倍的储存提取物一起孵育，并在37°C下孵育。平行设置对照试管，与1 mL来自携带空载体的大肠杆菌细胞的裂解物一起孵育。在不同时间间隔，测定水相中的浮游细胞计数。暴露于提取物后试管中保留的生物膜也按上述方法进行估算。

pH、温度和蛋白酶K处理的影响

为检查pH和温度对生物膜分散因子活性的影响，将如上所述制备的提取物等分样品（0.5 mL）接种到一系列含有4.5 mL调整至特定pH的PBS的试管中，并使用霍乱弧菌C6706菌株的生物膜按上述方法分析活性。最初在三种不同pH（6.0、7.0和8.0）和温度（25°C、37°C和50°C）以及这些参数的组合下检查活性。随后，在37°C下更详细地检查了pH（3、5、7、9、11和13）的影响。在pH 7.0下检查了温度（25°C、30°C、37°C、45°C、50°C和55°C）对因子活性的影响。总体而言，活性在pH 7.0和35°C至40°C的温度范围内最高。随后，所有其他测定均在37°C和pH 7.0下进行。

为检查蛋白酶K的影响，将0.5 mL细胞提取物与0.5 mL缓冲液（20 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS）混合。加入蛋白酶K至终浓度50 μg/mL，反应在37°C孵育2小时。然后按上述方法测试经蛋白酶K处理的提取物对霍乱弧菌C6706菌株生物膜的活性。

从水样中分离霍乱弧菌O1

选择用于此测定的环境水样最初通过常规富集培养发现霍乱弧菌O1为阴性。将500 μL大肠杆菌DH5α（pNSF18）的透析后细胞提取物与2.0 mL水以及2.5 mL 5×浓缩的胆汁蛋白胨培养基（BP, 1%蛋白胨, 0.5%牛磺胆酸, 1% NaCl, pH 9.0）混合，并在37°C孵育5小时。平行孵育用含有空载体的大肠杆菌DH5α提取物富集的样品作为对照测定。按照AST富集培养技术，将富集培养物的稀释液涂布在含有链霉素（70 μg/mL）的TTGA平板上。挑选疑似霍乱弧菌O1的单个菌落，并进行标准血清学测试以确认，并使用特异性PCR检测毒力基因ctxA和tcpA。

统计分析

在适当时使用Microsoft Excel（2016版）内置的统计分析程序计算平均值±标准差，并通过双尾t检验检验差异。P < 0.05的值被认为具有统计学显著性。

结果

JSF7噬菌体基因组携带推定生物膜降解因子的基因

对JSF7噬菌体完整基因组序列的分析显示，在由46,310个碱基对组成的基因组内共有49个ORF。JSF7噬菌体中近39%的预测ORF（49个中的19个）被发现具有预测功能。这些包括编码六种DNA代谢相关蛋白的ORF，包括DNA聚合酶、DNA解旋酶、噬菌体DNA包装蛋白、DNA连接酶、噬菌体RNA聚合酶。五个ORF被预测编码特定的噬菌体相关蛋白。有四个ORF编码噬菌体结构蛋白，包括噬菌体外壳蛋白、噬菌体尾丝蛋白、尾蛋白和噬菌体颈圈蛋白。值得注意的是，JSF7的基因组携带一个ORF（命名为ORF 30；2,796 bp），该ORF被预测编码一种多糖降解酶，果胶裂解酶/环交替聚糖水解酶，并被怀疑是生物膜降解因子。如上所述，将该ORF克隆并表达在大肠杆菌DH5α中，以确认重组菌株细胞提取物的生物膜降解活性。JSF7噬菌体的基因组序列和推定的生物膜降解因子的序列可在GenBank登录号KY065149下获得。

携带克隆的JSF7噬菌体ORF30的大肠杆菌提取物分散细菌生物膜

预测编码多糖降解酶的ORF30从JSF7噬菌体DNA中通过PCR扩增，并克隆到pGEM-T克隆载体中以构建pNSF18，然后导入大肠杆菌DH5α。通过SDS-PAGE分析来自大肠杆菌DH5α（pNSF18）和携带空载体的大肠杆菌DH5α的总蛋白提取物，显示在大肠杆菌DH5α（pNSF18）的提取物中出现一条约37 kDa的额外蛋白条带，但在携带空载体的大肠杆菌DH5α的提取物中未出现。

使用霍乱弧菌C6706菌株产生的生物膜比较了编码推定多糖降解因子的重组克隆的细胞裂解物提取物和完整JSF7噬菌体的生物膜降解活性。暴露于完整JSF7噬菌体或重组克隆的提取物均导致生物膜相关细胞的分散，这从生物膜的减少和随之而来的细菌细胞计数的增加可以明显看出。类似地，在本研究包括的大肠杆菌DH5α、铜绿假单胞菌和痢疾志贺氏菌1型菌株的单菌种生物膜上观察到大肠杆菌（pNSF18）细胞提取物的生物膜降解活性。

JSF7-ORF30基因产物增强水样中霍乱弧菌O1的检测

由于发现含有克隆生物膜降解因子的粗提物在实验室条件下能分解生物膜，我们检验了该粗提物是否也能增强从孟加拉国环境地点采集的水样中可能的生物膜相关细菌的回收率。为排除可能含有少量浮游霍乱弧菌O1细胞的水样，按先前描述的方法通过富集培养测试水样等分样品中霍乱弧菌的存在，并且仅将在此初步筛选中发现为阴性的样品纳入此测定。我们发现，添加来自携带克隆ORF30的大肠杆菌DH5α的提取物（体积比50%）在富集几小时后显著增加了许多水样中霍乱弧菌O1的检测。当以相同方式富集和培养，但暴露于来自携带空克隆载体的对照大肠杆菌DH5α培养物的提取物时，这些相同水样的等分样品大多被发现霍乱弧菌O1为阴性。

讨论

细菌和噬菌体在水生环境中无处不在，是整体生态环境的重要组成部分。虽然环境中的细菌通常以生物膜形式持续存在，但偶尔噬菌体拥有生物膜降解酶，以便能够接触到假定否则不受噬菌体影响的生物膜相关细菌。JSF7代表了这样一种噬菌体，它可以捕食生物膜相关的霍乱弧菌O1，最初是从霍乱流行的孟加拉国的水生环境中分离得到的。从水中分离出的36种不同的霍乱弧菌特异性噬菌体中，只有JSF7噬菌体能够降解生物膜。对JSF7噬菌体基因组序列的分析表明，命名为ORF30的2,796 bp的ORF预测编码一种称为果胶裂解酶或果胶酶的酶，它属于一组称为糖苷水解酶的酶。在先前的一项研究中，来自根霉属的果胶酶被发现能在体外高效分散单菌种和多种菌种的生物膜。本研究旨在克隆负责生物膜分散的推定JSF7噬菌体基因，并在大肠杆菌中表达，以便可以方便地制备重组菌株的粗细胞提取物，并应用于增强环境水样的细菌学分析，这些水样通常含有抵抗常规培养方法的细菌生物膜。因此，测试了携带重组质粒pNSF18的大肠杆菌DH5α的粗细胞提取物在降解实验室制备的细菌生物膜以及分析环境水样中经常在孟加拉国引起霍乱的霍乱弧菌O1方面的效果。

用于制备这些单菌种生物膜的细菌菌株不仅包括对JSF7噬菌体敏感的霍乱弧菌O1，如菌株C6706，还包括其他对JSF7噬菌体不敏感的细菌，如痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌O139的菌株。重组大肠杆菌DH5α（pNSF18）的提取物能够降解所有测试的这些不同生物膜。当使用完整噬菌体降解霍乱弧菌O1菌株C6706的生物膜时，随着生物膜的减少，浮游细胞计数的随之增加相对少于使用重组克隆提取物时。这种差异是预期的，因为霍乱弧菌O1菌株C6706对JSF7噬菌体敏感，因此假定从生物膜释放的部分浮游细胞被噬菌体裂解。相反，当使用完整噬菌体或克隆的基因产物时，痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌或霍乱弧菌O139等细菌的生物膜的降解导致浮游细胞计数稳定增加。

已知霍乱病原体霍乱弧菌在霍乱流行的地区的水生环境中持续存在。然而，从水样中分离该病原体很困难，因为它们以类似生物膜的休眠细胞聚集体形式存在，称为条件性可活环境细胞（CVEC），这些细胞难以通过常规富集和培养技术生长。然而，这些潜伏细胞能够在自然条件下定期复苏并引起霍乱暴发。先前已证明通过使用自体诱导剂分散CVEC可以回收活跃生长的霍乱弧菌O1，这些自体诱导剂通过群体感应途径增强生物膜的分散。群体感应是指细菌中基于细胞密度的调节反应，通过感知细胞外自体诱导剂发生，这些诱导剂由细菌群落产生。相比之下，在本研究中，我们使用了一种噬菌体编码的酶，该酶被克隆并表达在大肠杆菌中，以直接分散生物膜并释放可通过培养检测的霍乱弧菌浮游细胞。这些结果表明，在大肠杆菌中表达的JSF7噬菌体的克隆基因产物有可能用于增强水样的微生物学分析。值得注意的是，监测水的微生物质量是追踪水传疾病传播和预测暴发风险的关键步骤。

这项研究的结果还提供了其他几个重要的见解。除了霍乱弧菌，许多其他致病菌，包括创伤弧菌、空肠弯曲菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌和肠炎沙门菌，已被发现在不利环境条件下呈现休眠状态。在本研究中，我们表明克隆的生物膜降解因子可以作用于多种细菌的生物膜，这表明其应用在分析环境样品方面可能更广泛。除了霍乱弧菌O1和霍乱弧菌O139，我们还证明了它对其他细菌病原体（如痢疾志贺氏菌1型和铜绿假单胞菌）生物膜的活性。这些致病菌被纳入测定中以测试噬菌体基因产物降解生物膜的功效，因为使用抗菌药物根除生物膜相关病原体是一项挑战。进一步的研究将致力于调查在存在噬菌体衍生的生物膜降解因子的情况下，对生物膜相关细菌感染的抗菌治疗是否更有效。

本研究也有几个局限性，未来可能需要解决。糖苷水解酶作为一个组包括许多酶，如α-淀粉酶、藻酸盐裂解酶、果胶酶、淀粉葡萄糖苷酶、菊粉酶和木聚糖酶，由不同生物体产生，具有不同水平的生物膜分散活性。在本研究中，ORF30被预测编码一种果胶酶，并且确实，重组产物在粗提物中显示出生物膜降解活性，并有助于增强水的细菌学分析。然而，我们没有纯化该酶，也没有研究该酶的生化参数，这在将其开发用于工业或诊断应用之前是必要的。在先前的一项研究中，筛选了16种GHs在不同环境中生长的生物膜的分散能力，并注意到某些差异。因此，将JSF7衍生酶的生物膜分散活性与其他可用的GHs进行比较将是有用的。同样，需要将粗提物的有效性与其它生物膜分散策略进行基准测试，例如商业酶、化学分散剂或群体感应诱导剂。最后，观察到的环境水样中霍乱弧菌O1检测的增强可能需要在不同环境中用更多样品进行进一步评估。

结论

我们鉴定了一种能够分解细菌生物膜并分散生物膜相关细菌的噬菌体。我们将负责该活性的推定噬菌体基因克隆到大肠杆菌菌株中，并发现重组大肠杆菌的粗细胞提取物可以促进多种细菌生物膜的降解。在细菌生长培养基中添加粗提物也增强了对环境水样中霍乱弧菌O1的检测。因此，在大肠杆菌中异源生产噬菌体衍生的生物膜降解因子在水的细菌学分析中具有潜在适用性。该活性因子在37°C左右的温度和pH 7.0下稳定且具有活性，这使得无需维持冷链即可方便地储存和使用它。然而，如上所述的本研究的局限性强调了纯化、进一步验证以及与现有生物膜分散方法进行比较的必要性。这种生物膜降解因子的进一步纯化和表征可能会导致其更有效的应用，未来的努力将朝着这个目标迈进。

伦理批准

本研究不涉及任何来自人类受试者或脊椎动物的标本或数据。仅使用天然水样。研究计划经icddr,b的研究审查委员会审查和批准（协议号PR-15029）。