年轻洋壳深海热液喷口亚海底自养菌的代谢与种群动态及其生态意义

《Applied and Environmental Microbiology》：Metabolic and population profiles of active subseafloor autotrophs in young oceanic crust at deep-sea hydrothermal vents

　　本文通过RNA稳定同位素标记技术，揭示了深海热液喷口亚海底自养微生物群落在不同温度、地球化学和地质条件下的功能动态与分布规律。研究发现，氢营养型硫/硝酸盐还原菌（如Aquificota和Campylobacterota）作为“通才”广泛分布，而产甲烷古菌等“专才”则受限于特定环境。研究强调了氢和氧的可用性对群落结构的调控作用，以及微生物对氢利用策略的多样性（如多种氢酶基因），为理解深海黑暗生态系统的初级生产机制提供了新视角。

　　

摘要

在深海热液喷口，由岩浆驱动的岩石-水反应在洋壳中产生气体和其他还原性化合物，亚海底微生物利用这些物质进行化能自养。本研究利用RNA稳定同位素探测技术，对2013年和2014年从轴向海山三个弥散流热液喷口采集的样品中的微生物自养菌进行了同位素标记，靶向了亚海底的中温（30°C）、嗜热（55°C）和超嗜热（80°C）自养菌。我们构建了活跃化能自养菌的分类学和功能谱图，检查了种群在不同位点的分布，并将初级生产者与其在亚海底群落中的特定代谢策略联系起来。优势自养菌表现出氢依赖的异化代谢，如硫和硝酸盐还原以及产甲烷作用，甚至在80°C时也存在微好氧的硫化物氧化，这与各站点的流体化学特征一致。虽然氢营养型产甲烷古菌的分布和活性受限，但来自Aquificota和Campylobacterota的氢营养型硫和硝酸盐还原菌在所有站点和年份的种群及群落水平上均持续活跃存在。氢酶转录本显示出显著的差异表达，并且在Aquificota成员的宏基因组组装基因组中发现了多样化的氢酶，突显了其氢利用策略的重要性和多功能性，这可能是它们在不同地球化学特征的亚海底位点广泛分布的原因。总之，本研究为深海热液喷口年轻洋壳中关键亚海底自养微生物群落的功能动力学和分布提供了新的见解。

引言

深海热液喷口跨越了从寒冷的氧化海水到由岩石-水反应产生的炎热、高度还原的热液流体的巨大温度和地球化学梯度。它们承载着多样化的微生物生态位，许多由化能自养作用驱动。通过弥散流喷口可以对海底及以下的混合区进行采样，为了解洋壳内的亚海底栖息地提供了一个窗口。尽管对深海热液喷口的地球化学和微生物学的认识日益增加，但我们对在这些位点固定大部分碳的关键微生物参与者，尤其是在高产的亚海底环境中的了解仍存在空白。

本研究建立在轴向海山弥散流流体研究的传统之上，提出了来自同一轴向海山三个弥散流喷口站点的两年RNA-SIP数据，旨在研究轴向海山活跃的微生物亚海底自养菌如何随温度、流体化学、喷口地质学（硫化物与玄武岩）、空间和时间而变化。我们假设每个喷口和温度下的亚海底自养微生物种群结构将是独特的，其转录代谢谱反映每个个体喷口的地质和地球化学特征。

结果

喷口流体的化学特征

所有弥散流喷口的化学特征显示，采样期间温度范围为18.5至28.2°C，pH平均约为5.6，各站点的微生物细胞浓度数量级相同，但三个喷口之间的弥散流体化学成分存在明显差异。新的原位氧数据显示，所有喷口位点相对于轴向海山破火山口内的近底层海水都呈耗竭状态。氧对温度的线性回归表明，氧在每个站点的行为不同。

RNA-SIP实验

总共在2013年和2014年进行了15组RNA-SIP实验。所有15组RNA-SIP实验均显示，与¹²C标记的对照相比，¹³C标记的实验中的RNA具有更重的浮力密度峰，表明标记的碳酸氢盐被吸收到RNA中。本研究共包括84个宏转录组。通过实时定量逆转录PCR对16S rRNA拷贝数进行标准化。

未处理流体和RNA-SIP实验¹³C富集部分微生物群落的分类组成

未处理的流体宏转录组代表了通过海底过滤和立即用RNALater固定时具有可检测转录本的类群。在所有30°C的¹³C富集RNA-SIP宏转录组中活跃的所有属也在未处理的流体宏转录组中被鉴定出来。在30°C时，Campylobacterota在所有三个站点的活跃群落中占主导地位。与30°C的¹³C富集部分相比，55°C时分类学的主要差异是来自Cetia、Caminibacter、Nautilia和Hydrogenimonas的转录本相对丰度转向更高。与30°C和55°C时Campylobacterota在SIP实验和未处理流体中都很丰富不同，80°C时许多¹³C富集的活跃类群在未处理流体中丰度较低。

宏基因组组装基因组

对所有未处理的弥散流流体、背景和羽流宏基因组的共组装进行分箱，产生了391个分箱，经过质量过滤后剩下120个MAG。最终选择了11个MAG，基于在任何单个RNA-SIP ¹³C富集部分中其编码基因组的>4%被表达。高度转录的MAG的分类组成与基于ORF的转录本分配一致。

¹³C富集活跃自养菌的功能属性

为了确定¹³C富集部分的化能自养菌在吸收标记碳酸氢盐的同时如何获取能量，我们鉴定了涉及氧、氮、甲烷、氢、硫和碳固定途径的关键基因的转录本，并将其与未处理的流体宏转录组进行了比较。在所有站点和样本中，主要代谢途径存在相似之处，但在每个年份和温度下，三个喷口站点的转录幅度不同。

¹³C富集转录本的差异表达分析

使用RNA-SIP ¹³C富集转录谱进行差异表达分析，以确定跨实验条件下转录的统计差异，而不偏向任何特定的功能注释。在所有¹³C富集的RNA-SIP宏转录组中，有656个独特基因被显著差异表达1,520次。

讨论

本研究通过实验操作喷口流体，靶向可变温度条件下的亚海底微生物，并利用稳定同位素标记与无机碳配对结合宏转录组测序，重点关注活跃的亚海底自养微生物、它们的代谢和生长策略及其在亚海底的分布。虽然我们的结果广泛证实了我们的假设，即每个喷口和温度下的亚海底微生物种群结构是独特的，但通过仅关注特定温度下的自养菌，我们也发现了活跃的、普遍存在的、占据所有站点特定热生态位的亚海底自养菌，无论喷口的地球化学或地质情况如何。某些代谢和相关谱系是分布受限的，而其他代谢则广泛分布在许多谱系中，跨越广泛的温度范围，突出了该生态系统中不同分类群之间的代谢灵活性和功能冗余。

所有¹³C富集的RNA-SIP实验都经历了未处理流体宏转录组中存在的类群的显著精炼。值得注意的是，Alpha-、Delta-和Gammaproteobacteria以及Actinobacteria的减少或消失，这些类群在未处理流体中构成了高达一半的微生物群落，并且在羽流和背景海水样本中很常见。

受限的产甲烷作用与广泛的氢利用

弥散流喷口流体的地球化学剖面一致表明所有站点和年份间都存在生物氢利用，但甲烷生产仅在马arker 113和Marker 33明显。这些生物活性的地球化学指标大致映射到以代谢为重点的分析。¹³C富集的产甲烷作用转录本仅限于Marker 113和Marker 33。相比之下，在Anemone，与产甲烷作用相关的¹³C富集转录本在最高表达的30个基因中缺失，并且与其他站点相比显著低表达。

虽然产甲烷作用局限于两个喷口，但所有站点都显示出氢的生物利用，在Marker 113和Marker 33，还有硝酸盐的利用。¹³C富集的氢和硝酸盐利用转录本在所有条件下都很丰富。

普遍存在的种群作为亚海底“通才”

在每个年份中，都有MAG在所有喷口的至少一个时间点活跃：Hydrogenimonas bin 102，Nautiliaceae bin 340，Thermovibrio bin 320和Desulfurobacteriaceae bin 324。跨喷口和温度的活跃MAG的重复出现表明，轴向海山的一些喷口拥有相同的微生物种群，与喷口地质学或地球化学无关。

普遍存在的类群Hydrogenimonas和Nautiliaceae，在30°C和55°C实验中回收，能够进行氢营养型硫和硝酸盐还原，并且是高效的氢氧化剂。与来自Hydrogenimonas和Nautilia的培养代表的研究结果一致，这些研究强调了其基因组中氢利用的灵活性，我们的MAG分析表明，分类学上归属于这些属的分箱在55°C时表达了四个氢标记基因中的三个，表明氢酶基因在这些种群中具有功能活性。

氢酶基因的转录本也在80°C的群落水平和普遍存在的Aquificota MAGs中检测到，支持了该门类群中氢氧化作用的普遍性和重要性。

亚海底产甲烷菌和Aquificota对氢的竞争

氢也被这些喷口的氢营养型产甲烷菌利用，产甲烷菌和Aquificota的普遍存在的氢营养型硫和硝酸盐还原菌之间对氢的竞争可能发生在温度>50°C的亚海底。通过将局部H₂浓度降低到产甲烷作用可以发生的分压以下，这些其他类群的生长可能会抑制产甲烷菌的生长。

影响氢利用微生物分布和代谢策略的另一个因素是热液喷口的物理特征。我们的结果支持这些培养和建模研究，并表明在自然界中，产甲烷菌需要更特定的物理化学条件才能成功生长，从而限制了它们的分布，而多样的Aquificota和Campylobacterota具有更高的代谢灵活性，并且较少依赖于流体停留时间限制的地球化学，从而实现了更广泛的分布。

温度依赖的氧体系结构塑造活跃自养群落

新颖的原位氧传感器数据使得对氧作为跨温度和喷口位置的亚海底微生物代谢终端电子受体的重要作用有了新的认识。微生物群落组成随温度和站点而变化，Campylobacterota在所有¹³C富集的RNA-SIP宏转录组中占主导地位，直至80°C。

在Marker 113，氧浓度是所有三个喷口中最低的。虽然流体停留时间和流速影响氧合作用，但Marker 113相对较低的氧浓度可能部分是由于Sulfurimonas的O₂消耗。在Marker 113和Anemone的30°C表达谱中，Sulfurimonas仅转录cbb₃型细胞色素c氧化酶基因，而没有其他替代电子受体的基因，暗示了一种氧还原和氢氧化代谢。

在Marker 33，Sulfurimonas和Hydrogenimonas在30°C时以相当的比例被回收。在这里，氧持续存在至52°C，更接近Hydrogenimonas的最适生长温度，可能允许这两个类群在该站点的更高温度下利用氧气。

除了低温模式外，高温下的氧可用性影响了每个站点80°C培养中的功能谱。线性回归模型显示，氧在Marker 113于33°C耗尽，在Marker 33于52°C耗尽，但在Anemone至少持续到100°C。这些氧模型与转录本数据一致，因为Anemone高温下氧的存在可能使得一些分类群能够在80°C实验中继续利用氧气进行微好氧的硫化物氧化。

结论

本研究在轴向海山三个空间分离的弥散流喷口历时两年识别了亚海底微生物初级生产者，并使得对深海热液喷口生态系统基础的化能自养微生物有了细致的观察。活跃的化能自养菌因喷口而异，表明喷口地质学、流体化学和流径塑造了观察到的地球化学环境和活跃代谢。微生物代谢和喷口流体化学之间的这种动态相互作用不仅影响群落结构，还决定了在各种环境条件下哪些类群占主导地位。氢和氧的可用性和利用是化能自养菌建立的关键控制因素，自养硫还原类群和产甲烷菌之间对氢的竞争是明显的。这些相互作用强调了热液喷口复杂的生态网络，其中微生物群落不仅适应而且还通过代谢交换和生态位分化积极塑造其环境。