微生物组与病毒组协同作用：黄铅笔珊瑚Madracis mirabilis在库拉索礁退化环境中的成功机制

《mSystems》：High microbial diversity, functional redundancy, and prophage enrichment support the success of the yellow pencil coral, Madracis mirabilis, in Cura?ao’s coral reefs

　　本研究通过宏基因组学方法揭示了黄铅笔珊瑚（Madracis mirabilis）在加勒比海库拉索岛退化珊瑚礁中成为优势种的微生物学机制。研究发现，与共生珊瑚相比，Madracis具有更高的细菌多样性（12%）和病毒丰富度（20%），其微生物组以Ruegeria和Sphingomonas等有益菌属为主导，表现出更高的功能冗余性。特别值得注意的是，前病毒（provirus）比例显著富集（50%），这些病毒携带抗生素抗性、中枢代谢和氧化应激响应基因，可能通过水平基因转移增强珊瑚全生物（holobiont）的环境适应能力。这项研究为理解珊瑚在人为压力下的恢复力提供了新的微生物学视角，对珊瑚保护具有重要启示。

　　

ABSTRACT

珊瑚礁在全球范围内经历了广泛的珊瑚丧失和群落组成变化。在这种背景下，一些珊瑚物种表现出天然的更强抵抗力，例如黄铅笔珊瑚Madracis mirabilis（以下简称Madracis）。在库拉索岛，尽管1973年至2015年间硬珊瑚覆盖率下降了78%，Madracis却成为优势硬珊瑚物种，占据了26%的珊瑚覆盖率，甚至在部分浅海礁区有所增加。虽然生活史特征和竞争机制有助于Madracis的成功，但这些因素可能无法完全解释其优势地位，因为其他具有类似特征的物种并未表现出可比的成功。

本研究通过低偏差的细菌和病毒富集方法对珊瑚样本进行宏基因组测序，获得了77个独特的细菌宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs）和2,820个病毒基因组序列。分析表明，与五种同域分布珊瑚物种的组合相比，Madracis相关的细菌和病毒群落分别丰富了12%和20%。Madracis相关的细菌群落以Ruegeria和Sphingomonas为主导，这些属先前已被证实与珊瑚健康、病原体防御和生物修复相关。这些群落还表现出更高的功能冗余，这通常与生态恢复力相关。病毒群落则显示出前病毒比例相对于其他珊瑚富集了50%。这些前病毒具有横向转移涉及抗生素抗性、中枢代谢和氧化应激响应基因的基因组能力，可能增强Madracis微生物组的适应能力，并促进其在库拉索礁的成功。

INTRODUCTION

珊瑚礁保护和恢复的一个有前景的方法是识别和探索在面临压力下表现优于预期的珊瑚物种和礁区。这些特殊案例可能为了解在环境压力源（如变暖、酸化或水质下降）下实现生存和稳定的生理、遗传和微生物适应机制提供见解。在加勒比海，黄铅笔珊瑚Madracis mirabilis尽管该区域珊瑚覆盖率急剧下降，却展现了这种恢复力。

库拉索岛的珊瑚礁在过去几十年中同样经历了全球礁区衰退的趋势。人为压力源导致珊瑚覆盖率下降、藻类增多和群落组成变化。尽管1973年至2015年间库拉索岛硬珊瑚覆盖率下降了78%，但Madracis已成为优势硬珊瑚物种，占据了26%的珊瑚覆盖率，甚至在部分浅海礁区有所增加。Madracis在靠近慢性人为压力源（包括营养负荷、污染和有机质输入）的区域表现出最高的生长和覆盖率。尽管这些压力源通常导致群落层面的变化和日益微生物化的礁区，对珊瑚健康有害，但Madracis表现出显著的恢复力，对影响许多其他物种的珊瑚病害相对不敏感。

生活史特征，如快速生长速率和高种群更新率，使得像Madracis这样的杂草型珊瑚物种对栖息地退化的影响具有特别的恢复力。作为一个高效的异养生物，Madracis从水柱中消耗浮游动物、细菌和颗粒物，这可能抵消由环境压力源引起的自养摄食（即光合作用）的典型减少。Madracis不仅在环境和微生物压力下茁壮成长，还与密集的底栖竞争者群落共存。其独特的形态——每个分支基部的组织随着群体扩张而后退——为 crustose coralline algae、海绵、藻类草皮、蓝细菌垫和其他底栖生物创造了多样群落的生存空间。这种与竞争者的相互作用可能通过肠系膜丝和清扫触手来解释其增强的攻击性。

虽然这些生活史、营养和攻击性特征可能对Madracis在库拉索岛的扩张和 dominance 有重要贡献，但许多珊瑚物种共享类似特征而未取得可比的成功。因此，这些特征可能无法完全解释Madracis不成比例的成功。

珊瑚全生物的微生物对珊瑚健康至关重要，并对其宿主的生理状态高度敏感。珊瑚全生物内微生物群落的组成是由这些共生微生物与环境条件之间的动态相互作用所塑造的。微生物组的成员也可能是垂直传播的，进一步促进了宿主特异性的群落结构。在这个框架内，一个有益的群落是根据多种因素选择的，包括宿主及其环境和生理背景。珊瑚相关微生物群落的失调已被确定为疾病的关键贡献者，其中常驻细菌在某些环境压力下直接作为机会性病原体发挥作用。其他微生物组成员为珊瑚宿主提供了显著的好处，正如有益珊瑚微生物（Beneficial Microorganisms for Corals, BMC）概念所强调的那样。有益微生物被认为通过关键功能（如病原体控制、有毒化合物中和和营养循环）在珊瑚全生物内竞争有害微生物甚至逆转失调。尽管微生物群落组成在不同珊瑚物种之间可能存在广泛差异，但微生物伙伴关系的灵活性可能在短期内为珊瑚提供优势，与基因突变和自然选择形成对比。微生物既可作为病原体又可作为适应性代理的能力突显了珊瑚-微生物关系的复杂动态及其决定竞争成功的潜力。

病毒也可能在调节珊瑚内微生物动态中发挥重要作用。噬菌体（感染细菌的病毒）作为水平基因转移的媒介，并对细菌群落施加自上而下的控制。在其他系统中，病毒捕食可以决定入侵细菌菌株的定植成功，并作为一种粘膜免疫形式发挥作用。病毒还可以携带可以调节宿主代谢、毒力和其他表型的辅助基因。通过病毒基因组整合（形成前病毒）的病毒和细菌之间的长期关系可以为细菌提供若干优势，例如对相关噬菌体超感染的免疫力和获得新基因，这可以传播有益性状，如抗生素抗性或毒力因子。此外，前病毒的持久性有助于维持细菌种群内的遗传多样性，促进在波动环境中的进化灵活性和适应。

本研究描述了与Madracis mirabilis、与之相互作用的珊瑚以及来自珊瑚边界层（coral boundary layer, CBL）的海水相关的细菌和病毒群落，以揭示这些微生物在Madracis生态成功中的潜在作用。我们假设Madracis微生物组显示出与群落多样性和遗传组成相关的独特特征，这些特征可能有助于支持这种珊瑚的持久性。

MATERIALS AND METHODS

Sample collection

图像、珊瑚活检和珊瑚边界层（CBL）海水样本于2022年6月在库拉索岛西南海岸的12个地点采集。在采样时，Madracis是库拉索岛调查礁区的主要石珊瑚，在底栖礁景中明显占主导地位。Madracis群体经常被观察到与包括邻近珊瑚物种在内的其他底栖生物直接竞争。在每个地点，对与五种其他珊瑚物种之一相互作用的Madracis斑块进行采样。相互作用区域被高分辨率成像以量化相互作用区域的结果。

使用凿子和锤子收集大约1 cm³（包含黏液、组织和骨骼）的珊瑚活检，并放入带有环境海水的自封聚乙烯袋中。样本在转移到CARMABI研究站实验室期间置于冰上（最长转移时间1小时），在实验室中去除环境海水，珊瑚样本被闪冻并储存在-80°C直至后续处理。为了与周围环境中的微生物组进行比较，使用配备30 cm长柔性管的500 mL注射器从每个Madracis斑块周围的四个区域收集CBL海水样本：Madracis指状结构内部（分支间；IB1）、覆盖Madracis的边界层（距离珊瑚表面10 cm内；BL1）、相互作用区上方的边界层（BL2）以及上游相同相互作用珊瑚物种的边界层（BL3）。BL3样本提供了一个物种特异性的比较，可以解释在没有与Madracis直接相互作用的情况下该珊瑚物种的背景微生物组信号。这种设计使我们能够更好地分离可能与相互作用本身相关的微生物特征。

Epifluorescence microscopy of coral boundary layer seawater

对于 epifluorescence microscopy，将1 mL原始CBL样本用多聚甲醛（最终浓度2%）固定，并真空过滤到0.02 μm Anodisc上。Anodiscs风干后，平放储存在-20°C，并置于冰上运输到迈阿密大学。在实验室中，通过将滤膜放在100 μL滴的SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（最终浓度10×）上10分钟来染色含核酸颗粒。通过从下方用两滴100 μL分子级水润湿Anodisc并用无绒抹布轻轻吸干滤膜底部来去除多余染色剂。滤膜在避光条件下风干30分钟，并安装在玻璃显微镜载玻片和盖玻片之间，使用20 μL mounting solution。使用油浸在630倍放大倍数下在ZEISS Axio Imager.A2上观察载玻片，使用ZEN图像处理软件。对于每个载玻片，为BL1、BL2和BL3捕获10张图像，为IB1捕获5张图像作为技术重复。将这些视野中的细胞和病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）的平均数量缩放到Anodisc的总面积，得到每个CBL样本中每mL的细胞和VLP计数。两个地点“Kokomo Beach”和“Tugboat Beach”由于载玻片质量低，影响了其下游分析的可靠性，因此从分析中移除。

DNA extractions and sequencing

对于CBL海水宏基因组，将每个地点的四个500 mL样本进行8.0 μm过滤，并用10% polyethylene glycol 8000（PEG）沉淀过夜。第二天早上，将PEG沉淀的细菌和病毒收集在0.22 μm Sterivex PES滤器上，并在-20°C冷冻以备后续处理。使用改良的Nucleospin Tissue Kit方案从六个地点的CBL海水样本（N = 21）的Sterivex滤器中提取DNA。海水样本作为环境对照，为周围水柱中存在的微生物和病毒群落提供背景背景。这些样本允许区分宿主相关和自由生活的类群。使用Nextera XT DNA Library Preparation Kit和IDT Unique Dual Indexes，使用1 ng DNA制备DNA文库。使用Illumina Nextera XT fragmentation enzyme进行片段化，然后进行PCR扩增（12个循环）并使用AMpure magnetic Beads纯化。使用Qubit 4 fluorometer和Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库进行定量。文库在NovaSeq平台2 × 150 bp上进行测序。

24个珊瑚样本的DNA提取遵循基于组织