从新墨西哥州的土壤中分离出新的病毒

《Microbiology Resource Announcements》：Recovering new viruses from New Mexico soils

　　病毒多样性评估及宿主预测方法研究。

　　这项研究通过宏基因组和尺寸筛选病毒组的测序技术，从美国新墨西哥州三个高海拔地区的土壤样本中成功恢复了4157个中等、高或完整质量的病毒基因组。这些病毒基因组的恢复，不仅揭示了土壤中病毒的多样性，还为理解其在生态系统中的作用提供了重要的数据支持。研究发现，90%的病毒基因组来自尺寸筛选的病毒组样本，表明这种筛选方法在评估复杂病毒组时具有关键作用。土壤病毒组通常包含大量的微生物，包括细菌、真菌、古菌等，它们在物质循环、基因水平转移以及生态系统的动态平衡中扮演着不可或缺的角色。然而，由于病毒难以培养和分离，传统的研究手段难以全面揭示其组成和功能。因此，利用现代测序技术进行病毒组的解析成为一种重要途径。

为了获取这些病毒基因组，研究团队从三个不同的高沙漠山脉中收集了土壤样本，每个山脉取样点相似的海拔高度，以确保研究结果的可比性。每个样本取样量为30克，随后被分为两部分，分别用于处理总宏基因组和尺寸筛选的病毒组。总宏基因组的处理涉及将土壤悬浮在含有蛋白的磷酸缓冲盐（PPBS）溶液中，通过摇晃、离心等步骤，再提取其中的DNA。而尺寸筛选的病毒组则通过使用特定的滤膜（如0.22微米）进行分离，从而去除较大的微生物颗粒，保留病毒颗粒。随后，利用DNeasy PowerSoil Kits（Qiagen）进行DNA提取，但采用了改良后的实验流程，以提高病毒基因组的回收效率。

在DNA提取之后，研究团队按照制造商的建议使用NEBNext Ultra DNA II Library Preparation Kit（New England Biolabs）构建Illumina测序文库，并采用151 bp的配对末端读取方式在Illumina NextSeq平台上进行测序。这一流程确保了高质量的原始数据，为后续的生物信息学分析奠定了基础。测序数据经过质量控制和接头序列去除后，利用FaQCs v2.10工具进行处理，以提高数据的准确性和可靠性。

随后，对宏基因组数据进行拼接，使用metaspades v3.12软件，并采用不同长度的k-mer（21、33、55和77 bp）进行分析。拼接得到的连续片段（contigs）被用于检测病毒，通过geNomad v1.9.0进行分类，并进一步使用checkV v1.0.3评估其质量和完整性。最终，研究团队保留了中等、高或完整质量的病毒基因组，共计4157个。其中，有563个病毒基因组被鉴定为完整质量，995个为高质量，而其余的则为中等质量。这些病毒基因组的长度和完整性差异较大，表明土壤中的病毒具有高度的异质性。

为了进一步分析这些病毒的生态功能，研究团队使用iPHoP v1.3.3工具预测其可能的宿主。该工具基于机器学习算法，能够高效地识别病毒与宿主之间的关系。研究发现，有124个病毒基因组可以被明确地分配到宿主，且预测的置信度超过90%。这些病毒主要与土壤中常见的细菌属有关，如*Mycobacterium*、*Pseudomonas*和*Streptomyces*。这些细菌在土壤生态系统中具有重要的功能，包括分解有机物、固氮、促进植物生长等，而病毒则可能通过感染这些细菌，影响其代谢活动和生态功能。

此外，研究团队还对病毒基因组进行了聚类分析，以识别其在物种水平上的分类。利用BLAST + v2.16.0中的blastn工具，将病毒基因组聚类为vOTUs（病毒操作分类单元），共形成了3867个聚类。这表明，大多数恢复的病毒基因组是独特的，即它们在土壤中并未被广泛发现或研究。同时，研究发现，89%的聚类仅由尺寸筛选的病毒组样本中获得，说明尺寸筛选方法在提高病毒组多样性方面具有显著优势。

通过这些分析，研究团队不仅揭示了土壤中病毒的多样性，还提供了病毒与宿主之间关系的初步证据。这一发现与以往的研究结果一致，表明基于尺寸筛选的病毒组富集方法在解析复杂病毒组时具有重要的应用价值。土壤病毒组的解析对于理解微生物在生态系统中的作用至关重要，尤其是在碳循环、氮循环等关键生物地球化学过程中。此外，病毒在土壤中的存在可能对微生物群落的结构和功能产生深远影响，例如通过基因水平转移促进生物进化，或通过感染宿主影响其代谢活动。

这项研究的结果还表明，尺寸筛选方法能够有效提高病毒基因组的回收率。与未经过筛选的总宏基因组相比，尺寸筛选的病毒组样本中病毒数量显著增加，平均为311个，而总宏基因组的平均为35个。这说明，尺寸筛选能够富集病毒，提高后续分析的效率和准确性。同时，病毒组的大小范围也较广，从3.8 Mb到1,046.6 Mb不等，进一步表明土壤中病毒的多样性极高，且不同样本之间的病毒组成存在显著差异。

研究团队还指出，这一数据集将成为未来研究土壤病毒多样性的宝贵参考。随着对土壤病毒的进一步探索，这一数据集有助于揭示病毒在生态系统中的潜在作用，以及它们如何与宿主相互作用。此外，病毒组的解析还可能为环境微生物研究提供新的视角，例如在土壤污染、生态恢复、农业可持续性等方面的应用。由于病毒在自然界中广泛存在，且在生态系统的物质循环和能量流动中发挥重要作用，因此对它们的深入研究具有重要的科学意义。

研究团队还强调了数据共享的重要性。原始测序数据已上传至NCBI SRA数据库（项目编号为PRJNA1263537），而完整病毒基因组则已发布至GenBank（访问编号为PV944424至PV944986）。此外，中等和高质的病毒基因组已上传至Dryad数据库，供其他研究者使用和分析。这种开放的数据共享模式有助于推动病毒组研究的发展，促进不同研究团队之间的合作和交流。

综上所述，这项研究通过先进的测序技术和生物信息学分析方法，成功揭示了土壤中病毒的多样性及其生态功能。研究发现，尺寸筛选方法在提高病毒基因组回收率和多样性方面具有显著优势，而病毒与宿主之间的关系也得到了初步解析。这些结果不仅为理解土壤病毒组提供了重要的数据支持，还为未来研究土壤生态系统中的病毒作用奠定了基础。同时，研究团队强调了数据共享和开放科学的重要性，为其他研究者提供了宝贵的资源。随着对土壤病毒的进一步探索，这些数据可能在环境科学、生态学、微生物学等多个领域产生深远影响。