多环境深度突变扫描揭示了细菌激酶中温度敏感变异体的分布情况

《Cell Reports》：Multi-environment deep mutational scanning reveals the distribution of temperature-sensitive variants in a bacterial kinase

　　蛋白激酶温度适应性研究揭示热抵抗变体通过增强催化活性而非稳定性适应高温环境，其突变位点广泛分布于蛋白核心和表面，传统稳定性预测方法无法有效识别此类变异。

　　本研究通过多环境深度突变扫描技术，系统地分析了温度对细菌激酶EnvZ的功能景观的影响。EnvZ是两组分信号转导系统中的一种传感器组氨酸激酶（HK），其功能依赖于与响应调节因子（RR）的相互作用，用于感知环境信号并调控基因表达。以往的研究主要集中在单一温度条件下进行深度突变扫描，而本研究通过在30°C、37°C和42°C三种温度下进行实验，揭示了温度变化对EnvZ突变体功能的影响机制。研究发现，温度敏感（ts）和温度耐受（temperature-resistant）的突变体分布广泛，不仅出现在蛋白质的核心区域，也出现在表面区域，这与传统观点认为ts突变主要发生在蛋白质核心的假设相悖。同时，研究发现温度耐受的突变体并不一定意味着蛋白质的热稳定性增强，而是可能由于局部结构变化导致酶活性增加，从而在高温下仍能保持功能。这一发现表明，传统的基于热稳定性的预测模型无法准确识别这些温度依赖的突变体，因此需要更系统性的实验方法来揭示突变对蛋白质功能的影响。

深度突变扫描是一种强大的技术，用于研究生物大分子的序列-功能景观。它能够通过高通量手段，确定模型蛋白中所有可能的单个氨基酸替换对功能的影响。然而，大多数深度突变扫描实验通常只在单一条件下进行，这使得环境因素对突变体功能的影响无法全面揭示。因此，本研究采用了多环境深度突变扫描的方法，对EnvZ进行了分析，以探索温度对突变景观的影响。研究发现，虽然EnvZ在不同温度下的突变景观具有一定的保守性，但某些突变体在不同温度下的功能表现存在显著差异。这些差异主要体现在温度敏感性和温度耐受性上，表明温度变化对蛋白质功能的影响是复杂的，并不能简单地归因于稳定性变化。

研究还发现，温度敏感性突变体的分布不仅限于蛋白质核心区域，还包括表面区域。这与传统的观点相悖，即温度敏感性突变主要发生在蛋白质核心，因为这些区域的稳定性对温度变化更为敏感。研究中发现，温度敏感性突变体主要出现在DHp结构域，该结构域是EnvZ与响应调节因子相互作用的关键区域。通过可视化突变体在EnvZ结构域上的分布，发现这些突变体不仅出现在核心区域，也出现在表面区域。这表明，温度敏感性突变体的形成可能与蛋白质结构的局部变化有关，而不是全局稳定性。

此外，研究还发现，温度耐受性突变体在高温下表现出更高的功能活性，这可能是因为这些突变体在高温下通过增加酶活性来补偿热稳定性下降。例如，某些温度耐受性突变体在高温下表现出更高的荧光信号，这可能是因为它们的基线活动较低，从而在信号存在时表现出更高的功能响应。这些结果表明，温度耐受性突变体的功能改善可能不是通过提高热稳定性，而是通过局部结构的优化，从而提高酶活性。

研究还通过计算模型（如FoldX和thermoMPNN）对温度敏感性和温度耐受性突变体进行了预测。然而，这些模型在预测温度敏感性突变体方面表现不佳，表明温度依赖性突变体的形成可能涉及多种因素，而不仅仅是热稳定性。因此，系统性的实验方法对于识别温度依赖性突变体的重要性被进一步强调。

此外，研究还发现，温度敏感性突变体和温度耐受性突变体在不同温度下的表达水平和功能表现存在显著差异。例如，某些温度敏感性突变体在高温下表现出显著的表达水平下降，而温度耐受性突变体则在高温下保持较高的表达水平。这表明，温度对蛋白质表达水平的影响可能是温度依赖性突变体形成的重要因素之一。

综上所述，本研究通过多环境深度突变扫描技术，揭示了温度对EnvZ突变体功能的影响。研究发现，温度敏感性和温度耐受性突变体的分布广泛，不仅限于蛋白质核心区域，还涉及表面区域。温度耐受性突变体的功能改善可能不是通过提高热稳定性，而是通过局部结构的优化，从而提高酶活性。这些发现挑战了传统观点，表明温度对蛋白质功能的影响是复杂的，并不能简单地归因于稳定性变化。因此，系统性的实验方法对于深入理解温度对蛋白质功能的影响具有重要意义。