零价铁强化低温厌氧氨氧化工艺：处理合成与市政污水过程中的微生物与理化变化

《Microbial Ecology》：Low-Temperature Anammox Supported by Zero-Valent Iron (ZVI): Microbial and Physicochemical Changes during Treatment of Synthetic and Municipal Wastewater

　　本研究针对厌氧氨氧化(Anammox)工艺在低温条件下性能受限的瓶颈问题，探讨了低剂量零价铁(ZVI)对AnAOB活性、氧化应激、酶活性及微生物群落结构的短期与长期影响。结果表明，低剂量ZVI(5-10 mg/L)在13-20°C能显著提升比厌氧氨氧化活性(SAA)，并调控HDH与NIR酶活性及氧化应激平衡；然而，在长期市政污水(MWW)处理中，ZVI的促进作用因生物质应激与有机负荷而减弱。该研究为ZVI在主流低温废水处理中的应用提供了重要理论依据。

　　

随着全球对污水处理能耗和可持续性要求的不断提高，厌氧氨氧化(Anammox)工艺作为一种高效、节能的生物脱氮技术，近年来受到了广泛关注。与传统硝化-反硝化工艺相比，Anammox工艺能够直接将铵离子(NH₄⁺)和亚硝酸根离子(NO₂^-)转化为氮气(N₂)，无需外加有机碳源，大大降低了能耗和运行成本。然而，这一工艺在实际应用中仍面临一个重大挑战：厌氧氨氧化细菌(AnAOB)的最适生长温度约为30±5°C，而实际市政污水的温度通常较低(8-20°C)，导致在低温条件下Anammox工艺的性能显著下降。

为了解决这一难题，研究人员开始探索各种强化策略，其中零价铁(ZVI)因其独特的物理化学性质而备受关注。ZVI具有较大的比表面积、强还原潜力(E° = -0.44 V)和在水中逐渐释放Fe(II)和Fe(III)的特性，这些特性使其在环境修复领域已有广泛应用。铁元素是AnAOB多种关键酶的辅因子，包括细胞色素、联氨合成酶(HZS)和联氨脱氢酶(HDH)，这些酶都参与Anammox代谢途径。因此，理论上ZVI可能通过提供必需的铁元素来增强AnAOB的代谢活性，特别是在低温胁迫条件下。

尽管已有研究表明ZVI在最佳温度下可以增强Anammox工艺，但其在低温条件下，特别是在真实市政污水处理中的效果和机制尚不清楚。大多数现有研究使用较高浓度的ZVI(克/升级别)，这可能带来生态毒理风险，而且这些研究多在优化的合成废水条件下进行，未能充分反映真实污水的复杂性。因此，探究低剂量ZVI(低于10 mg/L)在低温条件下对Anammox工艺的支撑作用，对于推动该技术在主流污水处理中的应用具有重要意义。

本研究由波兰格但斯克理工大学的Filip Gamon等人开展，发表在《Microbial Ecology》上，系统研究了ZVI在10-30°C温度范围内对Anammox工艺的增强效果，分别通过短期批次实验和长期序批式反应器(SBR)实验，评估了ZVI对微生物活性、氧化应激、酶活性及群落结构的影响，并考察了从合成废水转向真实市政污水处理过程中ZVI效果的稳定性。

为开展这项研究，团队运用了多种关键技术方法。研究使用了来自实验室SBR的悬浮Anammox生物质，并在严格控制温度、pH和溶解氧的条件下进行实验。短期效应通过中心复合设计(CCD)和响应面法(RSM)评估了温度和ZVI浓度对比厌氧氨氧化活性(SAA)的影响。氧化应激通过检测活性氧(ROS)生成和谷胱甘肽(GSH)水平来评估。酶活性分析重点测量了联氨脱氢酶(HDH)和亚硝酸盐还原酶(NIR)的活性。长期效应通过两个SBR反应器(一个对照，一个添加ZVI)在230天内处理合成废水和真实市政废水(MWW)来评估，并监测氮负荷率(NLR)、氮去除率(NRR)等性能指标。微生物群落结构的变化则通过16S rRNA基因的宏分类学测序进行分析。

短期效应

短期批次实验旨在探究温度和ZVI浓度对Anammox活性的联合影响。通过中心复合设计和响应面分析法，建立了温度(10-30°C)和ZVI浓度(4-11 mg/L)与比厌氧氨氧化活性(SAA)之间的数学模型。结果表明，ZVI的添加在一定条件下能显著刺激Anammox活性。例如，在27°C下，添加10 mg/L ZVI可使SAA提高30.5%，而5 mg/L ZVI在27°C和13°C下也分别能提高17.7%和7.7%的活性。数学模型(R2 = 0.90)和方差分析(ANOVA)均证实了ZVI对细菌活性的显著影响。研究还发现，ZVI与亚硝酸盐(NO₂^-)之间可能存在非生物反应，将其还原为铵(NH₄⁺)或氮气(N₂)，这在一定程度上也影响了氮的转化路径。这些结果说明，在低温条件下，低剂量ZVI可以作为有效的生物增强剂，但其效果受温度和浓度共同调控。

氧化应激

ZVI在增强Anammox过程的同时，也可能通过诱导氧化应激对微生物细胞造成损伤。本研究检测了ZVI对AnAOB细胞内活性氧(ROS)水平和谷胱甘肽(GSH)浓度的影响。ROS检测采用DCFDA荧光法，GSH含量通过荧光法定量。结果显示，ZVI浓度在5 mg/L时，ROS生成和GSH消耗均处于较低水平(ROS为103.6%，GSH为-13%)；而当ZVI浓度升至7.5 mg/L时，ROS和GSH水平均达到峰值(ROS 115%，GSH 21%)，表明在此浓度下氧化应激水平较高。ZVI在水环境中腐蚀释放的Fe(II)可通过芬顿反应与细胞内过氧化氢(H₂O₂)反应生成ROS，可能导致一种铁依赖性的程序性细胞死亡——铁死亡(ferroptosis)。然而，由于AnAOB是严格厌氧菌，其代谢过程中不产生氧气，因此由ZVI引起的氧化损伤相对有限，尤其是在低浓度下。这表明，低剂量ZVI对AnAOB的氧化胁迫风险较低，但浓度需谨慎控制。

酶活性

酶活性分析揭示了ZVI对Anammox关键代谢酶的调控作用。联氨脱氢酶(HDH)是催化联氨氧化生成氮气的关键酶，其活性随着ZVI浓度的增加(从1 mg/L到10 mg/L)而逐渐增强，从101%提升至121%。线性回归分析显示HDH活性与ZVI浓度呈正相关(R2 = 0.9431)。这表明ZVI释放的Fe(II)可能作为辅因子促进了HDH的活性。相比之下，亚硝酸盐还原酶(NIR)的活性在低ZVI浓度(2.5 mg/L)下有所增强(114%)，但在更高浓度(>2.5 mg/L)下受到抑制，在10 mg/L时降至71%。这可能是因为高浓度Fe(II)对NIR的代谢过程产生了抑制作用。这些结果说明ZVI对不同代谢酶的调控具有选择性，这可能会影响Anammox代谢途径的整体通量。

长期效应与真实污水处理

长期SBR实验历时230天，温度从30°C逐渐降至13°C，分为六个阶段。在阶段I(32-15°C)和阶段II(15°C)，添加ZVI(5 mg/L)的反应器(Z反应器)与对照反应器(C反应器)的氮去除率(NRR)相近，但Z反应器的SAA始终高于对照，提示ZVI在低温下可能起刺激作用。在阶段III-IV(14-13°C)，Z反应器在稳定的13°C条件下NRR和SAA均显著高于对照，表明ZVI在持续低温下能有效支撑Anammox代谢，可能通过改善反应器内的氧化还原条件和电子传递。

然而，当在阶段V(13°C)引入真实市政污水(MWW)后，两个反应器的性能均急剧下降。Z反应器的NRR与C反应器趋于一致，尽管其SAA仍较高。这表明在复杂污水基质中，有机负荷、其他离子(如Cl^-，可能导致ZVI钝化)以及生物质应激等因素削弱了ZVI的积极作用。污水中的有机物可能促进了反硝化菌的生长，改变了系统的脱氮路径。阶段VI改回合成废水后，活性仅部分恢复，且C反应器恢复程度略优于Z反应器，说明长期暴露于ZVI和MWW可能造成了持久的抑制效应，可能与ROS的过度积累有关。

微生物群落结构变化

宏分类学测序分析了微生物群落在不同阶段的动态变化。在门水平上，两个反应器均以变形菌门(Proteobacteria)为主，但其在Z反应器中的相对丰度(最高51.32%)高于C反应器(最高42.43%)。浮霉菌门(Planctomycetota，包含AnAOB)在Z反应器中的丰度也更高(最高28.14%)，表明ZVI可能促进了该门微生物的生长。在属水平上，ZVI的添加显著影响了群落结构。

例如，ZVI选择性促进了Candidatus Brocadia（一种重要的AnAOB）和Denitratisoma（反硝化菌）等属的富集。主成分分析(PCA)也显示这些菌属与ZVI处理密切相关。值得注意的是，在MWW喂养期间，Candidatus Brocadia的丰度在Z反应器中有所增加，研究者推测其可能激活了异化硝酸盐还原为铵(DNRA)途径以在低温下维持能量代谢。此外，Z反应器中Comamonadaceae_unclassified（具有铁还原和反硝化能力）和Ferruginibacter（铁氨氧化细菌）等菌属的丰度也显著高于对照，表明ZVI可能改变了系统的氮循环和铁循环路径。多样性指数显示，Z反应器的微生物多样性低于对照，但更具特异性，表明ZVI促进了功能菌群的专性富集。

可能的机制与理论意义

ZVI对Anammox系统的增强机制是多方面的。ZVI腐蚀持续释放的Fe(II)和Fe(III)是AnAOB关键酶（如HZS、HZO、NIR）和细胞色素c的必需辅因子，直接促进氮代谢和电子传递。在低温下，ZVI还能上调铁储存蛋白(bfr)基因的表达，帮助AnAOB应对铁限制。其次，ZVI能促进胞外聚合物(EPS)和群体感应信号分子（如C6-HSL、C8-HSL）的产生，有利于生物膜形成和颗粒化，增强系统稳定性。此外，ZVI本身可作为化学还原剂，将硝酸盐(NO₃^-)还原为亚硝酸盐(NO₂^-)，为Anammox提供底物。它还可能参与铁氨氧化(Feammox)和硝酸盐依赖型亚铁氧化(NAFO)等过程，进一步整合氮去除途径。

研究结论与讨论

本研究通过多角度分析证实，低剂量零价铁(ZVI)在短期和稳定的低温(15-13°C)条件下能有效增强厌氧氨氧化(Anammox)工艺的性能。其机制包括提供关键酶辅因子、调控氧化应激平衡、选择性刺激功能酶（如HDH）活性以及富集特定微生物类群（如Candidatus Brocadia）。这些发现表明，在受控的合成废水处理中，ZVI是一种有前景的低温Anammox强化策略。

然而，研究也揭示了ZVI应用的局限性。当系统处理成分复杂的真实市政污水时，有机负荷、可能的离子干扰（如氯离子引起的ZVI钝化）以及由此引发的微生物群落重构（如反硝化菌竞争）会显著削弱ZVI的积极效果。长期运行甚至可能导致不可逆的生物抑制。因此，ZVI在主流污水处理中的长期应用仍需优化，例如探索更精确的投加策略、与其他工艺（如部分硝化-厌氧氨氧化PN/A）的耦合，以及针对特定水质进行微生物群落调控。

总之，这项研究深化了我们对ZVI在低温Anammox系统中作用机制的理解，为开发更节能、更 robust 的主流污水脱氮技术提供了重要的科学依据和实践指导。未来的研究应聚焦于在实际污水处理厂条件下验证这些发现，并进一步探索ZVI与微生物组在分子水平的相互作用机制。