银大马哈鱼成纤维样细胞系CSFL-1NC的建立及其在宿主-病原体相互作用研究中的潜力

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》：Development and characterisation of a novel cell line derived from coho salmon (Oncorhynchus kisutch)

　　本研究针对银大马哈鱼（Oncorhynchus kisutch）缺乏体外研究工具的问题，成功建立了首株成年银大马哈鱼来源的成纤维样细胞系CSFL-1NC，并通过转录组分析、病毒易感性实验和基因编辑验证了其稳定性与功能性。该细胞系对传染性胰腺坏死病毒（IPNV）易感而对传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）耐受，为研究鲑鱼病原体特异性免疫机制提供了重要平台，有望替代部分活体实验并推动水产疫病防控研究。

　　

在水产养殖业蓬勃发展的今天，病毒性疾病如传染性胰腺坏死病毒（IPNV）和传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）对鲑鱼养殖业构成严重威胁。银大马哈鱼（Oncorhynchus kisutch）作为太平洋鲑鱼的重要物种，表现出对ISAV的独特耐受性，但其潜在机制尚不明确。由于缺乏可靠的体外研究模型，以往研究多依赖活体实验，存在成本高、周期长及伦理争议等问题。因此，开发银大马哈鱼的细胞系成为推动相关研究的迫切需求。

本研究通过采集野生银大马哈鱼胸鳍组织，利用组织块培养法成功建立了一株自发永生化成纤维样细胞系CSFL-1NC。细胞在L-15培养基（含20%胎牛血清）中稳定增殖，经超过65代培养仍保持形态一致性。研究通过转录组测序（RNA-seq）分析基因表达稳定性，利用伤口愈合实验评估细胞迁移能力，并采用免疫荧光染色（α-SMA标记）验证成纤维细胞特性。病毒易感性实验以IPNV和ISAV感染细胞，通过细胞病变效应观察和qPCR检测病毒复制；基因编辑实验通过CRISPR-Cas9系统敲除itgb4基因，并通过流式细胞术和测序验证编辑效率。

细胞形态与稳定性

CSFL-1NC细胞呈现典型的纺锤形成纤维样形态，在不同传代次数下均保持一致性。免疫荧光染色显示α-SMA阳性表达，支持其成纤维细胞身份。

转录组特征

RNA-seq分析表明，细胞在传代11、20和26时共有761个基因持续高表达，占顶级表达基因的60.3%，涉及核糖体结构和细胞生物合成等通路。成纤维细胞标志基因（如胶原基因colla1/colla2）表达稳定，而波形蛋白（vim）表达较低，符合鱼类成纤维细胞特征。

病毒易感性

IPNV感染引起显著细胞病变，病毒RNA水平较对照组升高约2.7×10⁶倍；而ISAV感染未引发明显病变，病毒复制水平极低（194倍变化），提示CSFL-1NC可能模拟了银大马哈鱼对ISAV的天然耐受性。

基因编辑潜力

CRISPR-Cas9系统对itgb4基因的敲除效率达93%，转染和慢病毒转导均可实现GFP报告基因表达，证明该细胞系适用于遗传操作研究。

讨论与意义

CSFL-1NC是首株成年银大马哈鱼来源的成纤维样细胞系，其转录组稳定性、病毒易感性差异及基因编辑适应性表明其可作为研究鲑鱼病原体免疫应答的理想工具。该模型有望减少活体实验使用，推动鱼类免疫机制比较研究，并为水产疫病防控策略开发提供新平台。未来需在更高传代次数下进一步验证其长期稳定性，并探索其在宿主-病原体相互作用研究中的广泛应用。