深海鳗草草甸作为抵御疾病和环境胁迫的避难所：温度与盐度对海草衰退病的影响研究

《Frontiers in Marine Science》：Deeper eelgrass meadows are refugia from disease and environmental stressors

　　本综述通过对比研究圣胡安群岛潮间带与潮下带成对鳗草草甸，揭示了深度、温度与盐度对海草衰退病（SWD）的关键影响。研究发现，较深的潮下带草甸环境更稳定（如最高原位温度低近14°C），疾病严重度（severity）比潮间带低2.24倍，且鳗草密度与疾病严重度呈负相关。最大海表温度（SSTmax）是疾病流行度（prevalence）的主要预测因子，而盐度变化范围（salinity range）则显著影响疾病严重度。研究强调潮下带草甸可作为应对气候变暖（如2018年热浪）和病原胁迫的重要避难所（refugia），为海洋生态系统保护提供了科学依据。

　　

1 Introduction

气候变化正显著影响陆地及海洋生命，并通过增加疾病风险产生间接影响。这些环境冲击引发生物多样性丧失，并导致沿海栖息地化学和物理特性的显著变化，尤其当它们影响像海草这样的基石物种时。温带海草鳗草（Zostera marina）因多重胁迫因素在全球和区域范围内均出现衰退。环境胁迫可与气候助长的病原体（如引起海草衰退病的原生生物Labyrinthula zosterae）相互作用。历史上的疾病爆发曾重创大西洋沿岸的鳗草草甸，如今，浪费病继续威胁着全球鳗草草甸的健康，特别是在像温度升高这样有利于L. zosterae的环境条件下。

与其他海洋疾病类似，较暖的温度与天然鳗草草甸中较高的浪费病流行度和严重度相关。实验室试验也表明较暖温度能促进病原体更快生长。升温可能不仅影响病原体毒力，也影响鳗草的抵抗力，因为海洋变暖已导致开花和繁殖产出减少以及存活率下降。最近的实验还表明，模拟的海洋热浪减少了接种L. zosterae的植株的地上部分生物量。当然，其他环境条件如深度和盐度也影响海草浪费病的发展轨迹以及鳗草的整体健康。例如，急剧的盐度波动会对鳗草造成胁迫。特别是对于在午间低潮时暴露的潮间带鳗草草甸，干燥作用是一个主要的环境胁迫因子，此外还有温度和深度。因此，多重环境胁迫可能影响海草浪费病的发展轨迹和鳗草健康。

鳗草草甸可以说是萨利希海近岸最重要且最具代表性的栖息地。圣胡安群岛以高浪费病水平和鳗草急剧衰退而突出。此外，水下摄像调查表明，圣胡安群岛在全州范围内过去20年草甸快速衰退方面表现异常。然而，初步野外调查表明，较深的潮下带草甸疾病水平较低，可能支持鳗草对多重胁迫的恢复力，或许可作为应对气候和病原胁迫的避难所。理解环境胁迫如何与病原体相互作用并影响海洋基石物种的健康和恢复力，对于有效监测和保护这些栖息地及其提供的生态系统服务至关重要。

本研究旨在检验以下假设：（i）潮下带草甸比相邻潮间带草甸具有更低的疾病流行度和严重度。（ii）相邻潮间带和潮下带草甸的热暴露范围不同，影响其疾病易感性。（iii）鳗草密度降低与较高疾病水平相关。（iv）较小的温度和盐度范围（即更稳定的环境条件）与较低的疾病流行度和严重度相关，因为更大的环境变异性可能比稳定环境条件对鳗草造成更大的生理胁迫。为解决这些问题，我们在华盛顿州圣胡安群岛的成对潮下带和潮间带鳗草草甸进行了浪费病调查（2017年7月-2019年7月）；我们还利用了原位和遥感温度、模拟盐度、疾病（流行度、严重度）和鳗草生物计量数据（密度、叶面积）。

2 Materials and methods

2.1 Field surveys

基于之前在华盛顿州圣胡安群岛的海草浪费病工作，我们在5个地点调查了疾病、叶面积和鳗草密度。每个地点都有成对的潮间带和潮下带草甸，并涵盖了一系列海表和原位温度及盐度。每次调查，我们在每个深度的海岸平行布设三条20米长的样带，目标对准每个草甸的中部以避免边缘效应。我们在低潮时收集潮间带调查的鳗草，通过浮潜或水肺潜水收集潮下带调查的鳗草。使用GPS坐标、罗盘航向和现场标记，我们每年返回相同的样带。潮间带草甸大约在平均低低水位以上+1米，潮下带草甸大约在-5.0至-9.8米之间。我们将疾病分析的鳗草收集标准化为每个枝条上的第三级（第三年轻）叶片。为了测量密度，我们沿着每条样带在0.25平方米的样方中计数鳗草枝条总数。

2.2 Disease measurements

在实验室中，我们在扫描前刮除叶片上的附生生物，使用Canon CanoScan LiDE 220扫描仪以600 dpi分辨率扫描。然后我们使用鳗草病斑图像分割分析器（EeLISA）这一稳健的机器学习算法分析所有图像，以进行精确的疾病和叶面积测量。EeLISA测量了每个第三级叶片的疾病流行度（存在/不存在疾病）和严重度（感染叶面积比例）。基于叶片水平的流行度，我们计算了地点水平的平均流行度（感染叶片比例）和严重度（仅从感染叶片计算）。先前的工作通过分子诊断方法确认了这些地点鳗草中存在L. zosterae。

2.3 Temperature data

为了评估疾病与海洋温度之间的联系，我们利用了遥感海表温度和原位温度数据。遥感温度可以提供比原位温度更高的时空分辨率，并允许计算异常指标，但可能无法捕捉精细尺度的环境条件。通过比较不同尺度测量的温度，我们能够更好地评估潮间带草甸的升温暴露和潜在胁迫温度。根据先前发表的方法，我们通过NASA喷气推进实验室OPeNDAP门户为每个地点提取了1公里空间分辨率的每日遥感海表温度，用于与来自HOBO TidBit温度记录仪的原位温度进行比较。我们在每个地点布设了1-2个潮间带记录仪，在整个3年调查期间以10分钟间隔连续记录温度。鉴于在潮下带草甸中寻找和回收小型记录仪的挑战，我们在每个野外季节开始和结束时在每个地点布设和回收了1个潮下带记录仪。

2.4 Salinity data

我们利用了来自萨利希海LiveOcean模型的每个地点的每日模拟盐度，该模型对萨利希海大部分区域具有500米水平分辨率。华盛顿海岸的海洋浮标记录原位环境参数，如盐度、温度和氧气。LiveOcean模型整合这些测量结果，提供72小时的海洋条件预测。这些稳健的数据为地方和区域海洋保护决策提供信息。我们绘制并视觉比较了每个采样日期的原位和模拟盐度，以确认模拟数据准确代表了近岸盐度。在这里，我们计算了每个地点每年夏季6月22日至7月20日期间模拟盐度的最大值、最小值、平均值和范围，以纳入疾病模型。

2.5 Statistical analyses

所有统计分析均在R v. 4.4.1中进行，并使用ggplot、ggpubr和RcolorBrewer包可视化数据。我们使用Rmisc包计算了地点水平的平均疾病流行度、严重度和标准误。为了比较深度之间的疾病流行度、严重度、密度和原位温度（平均值、最大值、范围），我们运行了非参数Wilcoxon检验。我们运行了非参数Kruskal-Wallis检验来分别评估潮下带和潮间带草甸的温度和密度的地点和年份差异。为了确定原位温度是否与遥感温度相关，我们运行了简单线性回归并视觉评估了拟合值与残差图。

为了检查预测变量关系，我们使用corrplot包评估了共线性，并可视化了温度、盐度、鳗草生物计量和疾病指标之间的相关性。与疾病流行度和严重度最密切相关的环境参数包括最大遥感海表温度、平均原位温度、模拟最小盐度和盐度范围。

我们使用广义线性混合模型（GLMMs，glmmTMB包）来评估叶片水平疾病流行度（二项分布）和严重度（Beta回归，logit链接）的预测因子。预测因子包括年份、温度、盐度、密度、深度以及生物学上相关的交互作用；地点和样带作为随机效应。我们总共运行了84个候选流行度和严重度模型。我们中心化并缩放所有数值预测因子，并从一个草甸-年份组合中排除没有密度数据的叶片。严重度分析侧重于感染叶片，使用 hurdle 模型方法；我们使用logit链接函数对严重度进行了logit转换。

我们使用校正的Akaike信息准则（AICc，MuMIn包）选择了最佳拟合的流行度和严重度模型。我们使用DHARMa包评估了模型诊断图。对于显著预测因子，我们计算了固定效应方差（边际R2，performance包）并估计了边际均值（emmeans包）以检验深度和年份效应。

3 Results

3.1 Eelgrass disease and density patterns

疾病流行度和严重度在潮下带草甸显著低于潮间带草甸。三年间，潮间带平均流行度为79.58 ± 1.09% SE，是潮下带流行度（57.27 ± 1.63% SE）的1.39倍。疾病流行度在2018年达到峰值，尤其是在潮间带草甸，并且在大多数地点保持持续高位（>50%），表明疾病广泛存在。

疾病严重度在潮间带鳗草中也较高，平均为15.06 ± 0.52% SE，而潮下带草甸为6.72 ± 0.51% SE（高出2.2倍）。严重度在2018年与流行度一起达到峰值，那年深度对比更强烈。大多数地点在2019年严重度降低，除了潮间带Beach Haven，其严重度进一步增加。三年中，最高的潮间带流行度和严重度出现在North Cove和Beach Haven，最高的潮下带疾病出现在North Cove和Fourth of July。

鳗草密度在潮间带草甸（84.5 ± 6.27 枝条/平方米）几乎是潮下带草甸（23.85 ± 3.18）的四倍。潮下带密度因地点而异但不因年份而异，而潮间带密度则因地点和年份均异。False Bay和North Cove具有最高的潮间带密度，False Bay具有最高的潮下带密度。2018年潮间带密度下降与高严重度同时发生，凸显了密度与疾病之间的反向关系。

3.2 Environmental characterization: temperature and salinity

原位温度捕捉了深度之间的精确热变化，并反映了潮下带草甸的强烈热缓冲作用。在所有年份和地点中，最大原位潮下带温度比潮间带最大值低14°C（潮下带：17.1°C，潮间带：31°C）。平均潮下带温度也显著低于潮间带平均值；潮间带草甸经历了13.9°C更大的热范围。这些模式显示了与夏季低潮期间极端潮间带变暖相比，潮下带草甸的热稳定性。

遥感海表温度揭示了精细尺度的地点内和地点间变异，并且通常比原位温度更暖，平均比潮间带温度高0.57°C，比潮下带温度高1.04°C。尽管如此，每日平均原位和遥感温度强烈相关。相比之下，温度范围在数据源之间不相关，凸显了原位监测对于捕捉局部极端值的重要性。

原位温度变化在深度之间以及跨空间和时间上也十分显著。平均潮间带温度因地点和年份而异。Beach Haven和Fourth of July具有最暖的潮间带平均值；Fourth of July经历了最高最大值。类似地，潮下带原位温度因地点和年份而异。在所有地点平均，2018年是最暖的夏季，2019年是最凉的。

盐度也反映了剧烈的时空变异。北部地点（North Cove和Beach Haven）表现出最大的变异性。南部地点相对稳定。这些差异反映在平均盐度上，北部的平均盐度低于南部。跨年份，2019年具有最高的平均盐度，与较凉的温度同时发生。最小盐度和盐度范围强烈相关，表明这两个指标都反映了低盐条件。模拟盐度通常与野外测量的盐度一致。

3.3 Temperature x salinity x density models

疾病流行度在潮下带草甸相比潮间带草甸显著降低，并随着最大遥感海表温度和叶面积的增加而显著增加；流行度在年份间显著变化。固定效应解释了疾病流行度方差的43.1%。

严重度在潮下带草甸显著降低，与盐度范围呈正相关，与平均鳗草密度呈负相关；严重度也在年份间显著变化。固定效应解释了严重度方差的30.5%。鳗草密度与严重度之间的关联在深度之间更为突出。North Cove和Beach Haven的可变盐度也与高疾病水平同时发生；这两个地点在三年中始终具有最高的潮间带疾病流行度和严重度。

4 Discussion

随着最近在圣胡安群岛相对原始的水域中量化了鳗草的大规模衰退，本研究旨在了解疾病的环境驱动因素并确定可能的避难所。我们对浅层潮间带草甸与相邻深层潮下带草甸的平行调查使我们能够评估潮间带鳗草的脆弱性以及潮下带栖息地作为病原和环境胁迫避难所的潜力。

4.1 Eelgrass disease and density patterns

在三年间调查的2,288片鳗草叶片中，潮下带草甸的疾病流行度和严重度持续低于潮间带草甸，支持了我们的第一个假设以及先前关于更深层鳗草更健康的研究结果。在潮间带草甸中，我们观察到2018年疾病流行度和严重度更高、温度更暖、鳗草密度降低，随后2019年温度更凉、疾病水平更低、密度增加。这些模式强调了变暖、疾病和鳗草衰退之间的联系，凸显了理解气候对鳗草健康和恢复力影响的需要。

4.2 Environmental characterization: temperature and salinity

每日平均原位温度追踪了遥感温度，但前者更好地捕捉了精细尺度的热胁迫，包括低潮时的空气暴露。潮间带草甸较高的疾病流行度和严重度支持了我们的第二个假设，即热暴露驱动疾病易感性。实验工作也表明较暖温度加剧了疾病。类似地，更深层的草甸对海洋热浪更具恢复力，并且具有潮汐冷却（邻近更凉的海洋入口）的草甸具有更高的密度和减少的热胁迫。总之，这些发现证明温度是鳗草健康和疾病的关键驱动因素。

模拟的每日盐度也与疾病严重度相关。北部地点广泛的盐度范围可能反映了弗雷泽河的影响，该影响在夏季随着冰川融化而加剧，并将高营养物和沉积物负荷向南带入圣胡安群岛。将模拟盐度纳入我们的分析加强了淡水输入和盐度降低影响鳗草疾病风险的证据。

4.3 Temperature x salinity x density models

我们的模型确定最大遥感海表温度是疾病流行度的关键预测因子，与先前表明热胁迫增加鳗草对L. zosterae的易感性并促进病原体传播的工作一致。相比之下，盐度范围是疾病严重度的强预测因子，表明可变的盐度一旦感染建立后会加剧病斑发展。总之，这些结果暗示了一个两阶段过程：炎热的海水温度可能引发疾病爆发，而盐度变异性可能加剧疾病严重度。这些发现强调需要考虑可能差异性地影响海草浪费病风险与进程的多重环境胁迫。

最大温度和盐度范围是疾病的重要预测因子，尽管两者都与相关指标高度相关。这种共线性使得难以完全厘清哪个具体指标驱动了疾病模式——是最大温度还是温度范围，是最小盐度还是盐度范围。尽管如此，我们的分析一致指出两个胁迫因子——海洋变暖（热浪或温度波动）和盐度波动（淡水脉冲）——对草甸尺度的浪费病至关重要。

高疾病严重度与可变盐度之间的关联表明稳定的盐度可能支持更健康的鳗草。虽然鳗草耐受广泛的盐度范围，但波动会减少生长和光合作用以及幼苗建立。盐度变异性也可与其他胁迫因子相互作用：河流羽流可输送减少光可用性的营养物和沉积物。低盐度结合高营养物在中宇宙实验和普吉特海湾的生物量模型中 dramatically 减少了鳗草生长并增加了死亡率。

潮间带草甸可能特别脆弱，因为它们较浅的深度使它们比潮下带栖息地更直接地暴露于淡水输入和其他胁迫因子（高温、干燥、波浪湍流、径流）。与热胁迫类似，急性盐度波动可能对鳗草和L. zosterae产生与慢性暴露不同的影响，强调需要考虑盐度胁迫的时间和持续时间。总体而言，盐度似乎是疾病进程的重要驱动因素，应纳入萨利希海鳗草地点适宜性评估以用于保护和恢复。

与温度（其与浪费病的联系已明确建立）不同，盐度-疾病关联的一致性较差。丹麦咸水区域的鳗草受历史疾病爆发的影响小于沿海草甸。实验室和野外研究报告了在较低盐度下更小的病斑和更低的疾病流行度。总之，这些报告表明盐度效应存在变异，但应仍然是鳗草胁迫评估的重点。最近一项研究检查了估计的最小海表盐度对太平洋和大西洋鳗草浪费病流行度的影响，但未发现盐度与疾病流行度之间的强关联。

鳗草密度与疾病严重度呈负相关：更密集的草甸疾病严重度降低。尽管这与疾病生态学理论（预测更高密度应增加传播）形成对比，但与先前东北太平洋的调查一致。一种解释是高疾病严重度减少了克隆生长并杀死枝条，留下更斑块化、植株更少、感染更严重的草甸。证明疾病减少叶片生长和地下淀粉储备的实验工作支持了疾病影响从个体延伸到整个草甸的观点。

许多（非）生物条件影响着此处未捕捉到的疾病动态。例如，东北太平洋的潮间带鳗草在夏季低潮期间经历干燥胁迫，水流可能通过海水和直接接触影响L. zosterae的传播。我们的工作不仅强调了温度和盐度对海草浪费病动态的作用，也强调了整合多样化原位、遥感和模拟数据的必要性。像萨利希海模型这样的工具提供了关于基本海洋栖息地如何响应环境变化的见解，并且在生态基线转变的背景下尤其重要。将此类模型与鳗草健康指标配对可能有助于识别更具气候恢复力的地点进行保护。

这项研究强调了在更深层潮下带草甸中环境