认知丰富改善空间记忆并改变早期生命应激小鼠模型的海马突触连接性

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Cognitive enrichment improves spatial memory and alters hippocampal synaptic connectivity in a mouse model for early-life stress

　　本文揭示了认知丰富训练（ET）能够逆转早期生命应激（ELS）诱导的空间记忆缺陷，并发现其机制与海马齿状回（DG）至CA3区苔藓纤维（MF）突触连接性的特异性改变相关，特别是减少了CA3胞体周围非典型兴奋性突触的数量，为理解环境干预对应激相关认知障碍的长期修复作用提供了新的突触机制见解。

　　

引言

早期生命应激（ELS）和丰富环境（EE）通常对长期认知能力产生相反的影响。生命早期剥夺，如婴幼儿神经发育关键期的机构化照料，会导致终生的记忆和工作记忆缺陷。相反，丰富环境能促进新学习，并减缓衰老和神经退行性疾病引起的认知衰退。在啮齿类动物模型中，丰富环境促进学习，而ELS则导致显著的空间记忆缺陷。环境丰富和ELS可引起海马结构（如突触密度的变化）的相反改变，但这些变化很大程度上取决于实验条件。然而，丰富环境是否能挽救ELS引起的行为障碍，以及这将如何影响老年期的海马体，尚待验证。

本研究通过一项纵向研究，对ELS小鼠进行认知丰富轨迹（ET）或单纯运动对照轨迹（CT）的广泛训练。随后，对小鼠进行重复记忆测试，并提取脑组织进行海马解剖学分析。研究发现，ET在6、13和20个月大时逆转了空间记忆缺陷，并减少了齿状回（DG）至CA3的突触数量。令人惊讶的是，这种减少发生在CA3锥体细胞层（stratum pyramidale）中围绕胞体的兴奋性苔藓纤维（MF）突触处——这一层通常不与MF末梢相关。这些发现表明，成年早期的认知丰富可能通过调整DG与CA3之间的突触连接性来逆转ELS诱导的空间记忆缺陷。

认知丰富挽救ELS小鼠的空间记忆缺陷

首先，使用有限垫料和筑巢材料（LBN）方法诱导ELS，该范式会导致随年龄增长而加重的记忆缺陷。随后将小鼠分为丰富组和对照组。研究采用简化版的ET训练方案（每周3次，每次30分钟），旨在更有选择性地惠及对ELS尤其敏感的海马回路。

在成熟期（6个月）、中年期（13个月）和老年期（20个月）对两组小鼠（ELS+ET和ELS+CT）进行物体位置记忆（OLM）和新物体识别（NOR）测试。结果显示，在OLM任务中存在显著的组间差异，ET组表现更好，但年龄和性别无显著影响。而在NOR任务中，未发现显著的组间、年龄或性别差异。在20个月大时，改用空间Y迷宫测试，ET组小鼠在新异臂探索时间上显著长于CT组，表明ET产生了终生的空间记忆挽救效应。

重要的是，实验设计控制了运动量混淆因素，因为两组小鼠均需跑动以获得奖励。事实上，CT组（在简单斜坡上跑动）完成的圈数多于ET组（需穿越复杂障碍物）。因此，额外的运动量无法解释ET组观察到的记忆增强。

ELS导致空间记忆缺陷

为验证ELS本身的影响，研究人员测试了另一组未经历丰富环境的雄性小鼠（ELS与典型饲养TR对照）。在成熟成年期（约6个月大）进行行为测试发现，ELS组在OLM任务中表现出记忆损伤，但在NOR任务中无显著差异。这与之前研究一致，表明ELS可能选择性地破坏海马依赖性记忆。

认知丰富未改变海马大体形态

尽管有研究表明丰富环境和ELS可引起海马子区（如苔藓纤维通路）的体积变化，但对这些表达GCaMP的ELS小鼠的成像分析显示，ET训练并未引起DG颗粒细胞层、门区或苔藓纤维上 blades 区域面积的显著差异，CA3神经元密度也无组间差异。这表明ET训练相比单纯运动对照组，并未导致DG至CA3回路的大体结构变化。

CA3胞体周围非典型MF突触的鉴定

为了可视化突触，研究人员使用了能够穿透固定组织的纳米抗体，从而可以在同一脑片中比较突触前、突触后标记物以及内源性GCaMP信号（MF指示剂）。免疫染色显示，在CA3锥体细胞层存在显著的大型突触簇，这在CA1等其它区域不明显。通过超分辨率成像，确认这些簇状结构是MF末梢（GCaMP信号）、突触后PSD-95和突触前Synaptotagmin 1的三重共定位，强烈支持在CA3锥体层存在兴奋性MF突触。

CA3 SP层非典型MF突触的特征分析

接下来，定量分析了ELS+ET和ELS+CT小鼠之间 putative 兴奋性MF突触的差异。对CA3弯曲处大片区域进行成像，自动计数分析显示，ELS+ET小鼠的突触簇大小分布与ELS+CT小鼠存在显著差异，ETS组有更少的大型簇和相对更多的小型簇。按CA3神经元数量标准化后，小鼠个体分析表明，ELS+ET小鼠平均每个CA3神经元的突触簇数量比ELS+CT对照组减少了约27%，但中位簇大小无显著组间差异，仅存在小型化趋势。这些发现表明，ET训练减少了ELS小鼠CA3胞体周围的MF突触数量，但未显著影响单个突触簇的大小。

讨论

本研究首次在母性忽视小鼠模型中证明，成年早期的认知丰富训练能导致空间记忆和海马结构的持久改变。与单纯运动对照组相比，丰富训练组在成熟期和中年期表现出长期OLM记忆的显著改善，并在老年期的Y迷宫测试中表现更好。但在依赖海马较少的NOR任务中无组间差异。

令人惊讶的是，解剖学分析发现老年ELS小鼠CA3神经元周围存在显著的MF相关兴奋性簇，而早期丰富环境减少了这些非典型MF突触的数量约25%。一个重要的注意事项是，在锥体层无法区分这些兴奋性MF突触是连接到锥体细胞还是抑制性中间神经元。然而，鉴于锥体细胞在数量上占绝对优势，观察到的减少很可能代表了锥体细胞上的连接。

行为观察与先前研究既有相似也有差异。本研究发现ELS选择性地损害空间记忆（OLM），而对识别记忆（NOR）影响较小，这与海马对ELS更敏感的观点一致。ET方案对海马功能具有选择性效应，可能与本次使用的简化版训练方案有关。

与预测相反，未发现MF体积的组间差异。先前在非应激小鼠中的研究报道丰富环境引起MF超越透明层（SL）的扩展，但那些研究未控制运动量。可能是运动而非认知丰富驱动了MF向CA3胞体的生长。

这些非典型突触以往未被充分表征的原因可能包括年龄和ELS导致的CA3树突萎缩和MF发芽，以及本研究使用的纳米抗体具有更优的组织穿透性。

关于丰富小鼠为何拥有更少的MF突触，一种可能性是认知训练触发了依赖于突触可塑性的突触修剪，例如长期抑制（LTD）的增加。ET任务中障碍物的频繁变化和重排可能促进LTD和后续的修剪过程。

此外，成年新生DG神经元的MF会扩展到SL层之外，提示这些非典型突触可能优先属于成年新生神经元。丰富环境可挽救ELS后新生神经元的存活，且新生神经元更具可塑性。成年新生DG神经元是否与CA3形成具有不同可塑性的MF突触，是未来需要澄清的问题。

本研究结果暗示，针对性的认知丰富训练可能对遭受ELS的个体特别有益。例如，玩3D视频游戏已被证明能改善人类的海马介导的记忆功能。未来研究可探索此类可及性干预措施是否能缓解早期逆境引起的长期认知和海马结构缺陷。

研究者提出了一个假设模型：年龄和应激会增加DG和CA3的兴奋性，可能导致MF输入驱动密集的 recurrent 活动，损害海马的模式分离能力。认知丰富引起的非典型MF突触数量减少，可能通过驱动更稀疏的 recurrent 活动来恢复模式分离，从而改善空间学习。

材料与方法

实验动物使用Thy1-GCaMP6f转基因小鼠，因其CA3区无报告基因表达。ELS通过 postnatal day 2-10 的LBN范式诱导。成年后，小鼠进行10周的ET或CT训练。行为测试包括OLM、NOR和Y迷宫。记忆表现通过辨别比率评估。脑组织提取后，进行免疫荧光染色（使用PSD-95和Synaptotagmin 1纳米抗体）和共聚焦成像。海马大体形态学分析通过宽场荧光显微镜进行。MF突触分析采用自动化的簇检测算法。统计分析使用重复测量和双因素方差分析。

总结

本研究结果表明，认知丰富训练（ET）能特异性逆转ELS诱导的空间记忆缺陷，其机制与海马DG-CA3通路中CA3胞体周围非典型兴奋性MF突触数量的减少有关，而非大体形态变化。这为理解认知干预对抗早期逆境神经精神后果的细胞机制提供了新的见解。