基于氨基酸同位素分析的低地溪流钩虾时空营养模式及其在生态系统恢复中的意义

《International Review of Hydrobiology》：Spatial and Temporal Patterns of Gammarus sp. in Lowland Streams Analyzed Through Amino Acid Isotope Analysis

　　本研究通过氨基酸特异性同位素分析（CSIA-AA）揭示了淡水碎食者钩虾（Gammarus sp.）在碳氮循环中的关键作用。文章系统阐述了其营养位置（TP）稳定性（TPGlu–Phe: 1.1–1.5; TP5AA: 1.4–1.8）以及δ13C和δ15N值的时空变异规律，为河流生态恢复提供了分子水平的监测新范式。

　　

1 引言

化合物特异性同位素分析（CSIA）已成为生态学研究中的重要工具，特别适用于解析水生环境中的摄食关系、食物网结构和营养循环过程。与传统整体稳定同位素分析（BSIA）相比，CSIA-AA技术能够提供分子水平的分辨率，有效区分碳氮来源的细微差异。尽管该技术在海洋生态系统中已有应用，但其在淡水生态系统尤其是时空梯度研究中的运用仍相对有限。

本研究以德国北莱茵-威斯特法伦州流域的钩虾（Gammarus spp.）为研究对象，通过2016、2018、2020和2022四年间的采样，首次系统开展了淡水碎食者的多年度氨基酸同位素分析。钩虾作为淡水生态系统中的关键碎食者，在营养循环和有机物处理中扮演核心角色。其食性主要包括落叶碎屑、附生藻类和微生物生物膜，支撑着更高营养级的能量传递。

2 材料与方法

2.1 研究地点与采样

研究区域位于德国鲁尔大都市区，包括博耶流域（Boye catchment）和作为参考点的罗特巴赫溪流（Rotbach stream）。博耶流域面积77平方公里，河流网络总长90公里，大部分属于沙质低地溪流（类型14）。下游段流经高度城市化区域，而上游段则被农业用地和森林环绕。该流域在2000年代前期主要作为开放式排污渠道运行，但在2007-2009年间基本去除了污水排放。

选取四个恢复站点（位于城市化区域）和一个参考站点（从未暴露于污水污染或水文形态退化）。采样在每年3月或4月进行，使用苏伯采样器（surber sampler）收集钩虾和底栖大型无脊椎动物群落样本。钩虾群落主要由Gammarus pulex和Gammarus fossarum组成，因鉴定困难统称为Gammarus sp.。

2.2 氨基酸δ¹⁵N和δ¹³C的CSIA分析

样本在乙醇中保存或冷冻处理。每站点每年随机选择9-31个钩虾个体，经去离子水清洗、48°C干燥36小时后研磨成均匀粉末。采用Riekenberg等人（2020）的方法制备样本，通过酸水解、脂质提取和衍生化处理，最终使用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱（GC-C-IRMS）测定氨基酸的δ¹³C和δ¹⁵N值。

测定了14种氨基酸的δ¹³C值（包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等）和9种氨基酸的δ¹⁵N值（包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等）。分析精度δ¹⁵N≤0.5‰，δ¹³C≤1.0‰。

2.3 数据分析

使用Excel和Origin Pro 2022进行数据分析。同位素比率采用δ表示法，以大气氮（AIR）和Vienna Pee Dee Belemnite（VPDB）作为标准。对衍生化过程中引入的碳进行校正，采用双向ANOVA分析站点和年份对氨基酸同位素值的影响，并进行主成分分析（PCA）识别同位素组成的关键模式。

2.4 营养位置计算

采用两种方法计算钩虾的营养位置（TP）：基于谷氨酸和苯丙氨酸的TP_Glu-Phe方法（Chikaraishi等，2009）和基于五种氨基酸的TP_5AA方法（Nielsen等，2015）。TP_Glu-Phe使用TDF_x?y = 8.0±1.2和β_x/y = 3.4±0.9，而TP_5AA使用Δ_x–Δ_y = 5.9‰±1.7‰和β_x/y = 2.9‰±0.9‰。

3 结果

3.1 钩虾氨基酸δ¹³C值分析

非必需氨基酸（NEAAs）的δ¹³C值普遍高于必需氨基酸（EAAs）。甘氨酸（Gly）是最富集¹³C的氨基酸（-7.8‰至-11.0‰），而赖氨酸（Lys）和苯丙氨酸（Phe）是最贫化的（分别为-27.1‰至-32.8‰和-23.4‰至-28.5‰）。苏氨酸（Thr）显示出异常的富集模式，与其他必需氨基酸不同。在非必需氨基酸中，脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）更为贫化，脯氨酸显示最低值（-20.4‰至-23.6‰）。

3.2 δ¹³C值的主成分分析

PCA显示前两个主成分累计解释76.8%的方差。PC1（59.3%）主要受丙氨酸（0.93）、蛋氨酸（0.93）和缬氨酸（0.92）影响，反映初级生产者的饮食输入和营养相互作用。PC2（17.5%）捕获碳源变异，苯丙氨酸（0.84）、异亮氨酸（0.68）和酪氨酸（0.53）呈正载荷，而苏氨酸（-0.55）、甘氨酸（-0.47）和丙氨酸（-0.37）呈负载荷。

3.3 钩虾氨基酸δ¹⁵N值分析

营养氨基酸（TAAs）显示较高的δ¹⁵N值（5‰-16‰），其中亮氨酸（Leu）变异性最高（7.3‰-16‰）。源氨基酸（SAAs）如苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）显示较低的δ¹⁵N值，Phe范围为1.2‰-7.6‰，Tyr为-2.5‰-4.7‰。代谢氨基酸（MAAs）如甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）最初具有较低的δ¹⁵N值（约2‰），但随时间显示增加富集，Gly达12.6‰，Ser达10.3‰。

3.4 δ¹⁵N值的主成分分析

PCA前两个成分累计解释94.8%的方差。PC1（77.4%）主要受谷氨酸（0.996）、苯丙氨酸（0.984）和缬氨酸（0.980）驱动，反映氮源和营养动态的变异性。PC2（17.4%）显示亮氨酸（0.87）正负载与甘氨酸（-0.47）和丝氨酸（-0.29）负负载的对比，表明向微生物或碎屑氮源的转变。

3.5 时空营养动力学

钩虾的营养位置估计在站点和年份间保持相对稳定：TP_Glu-Phe范围为1.1-1.5，TP_5AA范围为1.4-1.8。TP_5AA方法 consistently yielded higher values than TP_Glu-Phe，但差异小于0.5。两种方法均确认钩虾作为初级消费者的营养角色。

4 讨论

4.1 钩虾氨基酸δ¹³C值分析

δ¹³C分析揭示了钩虾在淡水生态系统碳流和摄食关系中的重要见解。非必需氨基酸较高的δ¹³C值表明这些氨基酸是在生物体内通过各种内部代谢过程合成的，而必需氨基酸则直接从食物中获取，保留了初级生产者的碳同位素特征。

4.2 氨基酸δ¹³C值的主成分分析

PCA揭示了碳源利用的显著时空变异。必需氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸与PC1强相关，反映了营养动态和初级生产者对碳流的影响。站点特异性趋势显示A站点保持稳定的饮食来源，而D和E站点在2018和2020年显示显著变化，表明对微生物或碎屑碳源的依赖增加。

4.3 钩虾氨基酸δ¹⁵N值分析

δ¹⁵N分析为了解营养相互作用、氮循环和环境变异性提供了关键见解。营养氨基酸的富集δ¹⁵N值支持其作为营养位置和食物网内氮分馏指标的作用。源氨基酸如苯丙氨酸较低的δ¹⁵N值表明其作为初级生产者氮输入可靠指标的价值。

4.4 氨基酸δ¹⁵N值的主成分分析

PCA强化了这些发现，揭示了不同站点间明显的氮源模式和营养动态。PC1捕获氮源和营养相互作用的方差，显示营养氨基酸和源氨基酸的强正载荷。相反，甘氨酸和丝氨酸在PC2上的负载荷表明在特定站点和时间微生物或碎屑氮贡献增加。

4.5 时空营养动力学

钩虾营养位置的稳定性表明其作为初级消费者的角色，严重依赖碎屑、附生藻类和微生物生物膜等基础资源。这种一致的喂养模式突出了钩虾在碎屑和放牧食物网内碳转移中的作用。

4.6 环境因素及其对同位素变异的影响

除资源组成和营养结构外，水温、河流流速等环境条件也可能影响钩虾的同位素组成。温度升高可加速代谢率和同位素周转， potentially attenuating trophic fractionation的表达。河流流速条件可调节基础资源的可用性和类型。

4.7 PCA揭示的同位素生态位梯度

同位素生态位梯度代表了生物体同位素组成的变化，通常与资源利用、营养功能或代谢途径的变化相关。多变量模式提供了基础营养资源使用的进一步见解。PCA清楚区分了站点和年份间的氨基酸同位素组成模式。

4.8 将同位素变化与钩虾功能角色联系起来

同位素数据表明，在恢复站点，钩虾更依赖微生物和碎屑，如非必需氨基酸中富集的δ¹³C值所示。这种向微生物途径的转变具有生态意义，因为钩虾在溪流落叶分解和营养循环中起关键作用。

5 结论

钩虾种群的氨基酸同位素分析为不同地点和时期淡水生态系统中的碳氮循环提供了宝贵见解。δ¹³C结果揭示了钩虾代谢和摄食策略的差异，非必需氨基酸通常显示比必需氨基酸更高的δ¹³C值。

研究证实了三个工作假设：空间变异性反映碳氮同位比率并取决于恢复状态；非必需氨基酸比必需氨基酸具有更高富集；钩虾营养位置保持低而稳定，作为初级消费者发挥作用。

详细而言，PCA结果表明，虽然一些站点保持稳定的摄食关系，但其他站点（特别是在2020和2022年）显示对微生物或碎屑碳源的依赖增加。类似地，δ¹⁵N值反映了氮源的变化，营养氨基酸指示更高摄食水平，而源氨基酸反映基线氮贡献。

这些发现表明，钩虾主要作为初级消费者功能，严重依赖碎屑、附生藻类和微生物生物膜等基础资源。本研究为淡水食物网的结构和功能提供了重要视角，表明钩虾可能对维持环境平衡和促进营养循环至关重要。

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