耦合凝胶电泳与光致发光成像技术揭示现代与化石贝壳中生物色素复合物的新方法

《Methods in Ecology and Evolution》：Coupling gel electrophoresis with photoluminescence reveals biochrome complexes in modern and fossil shells

　　本文开发了一种结合凝胶电泳与光致发光（PL）光谱成像的创新方法，成功实现了对贝壳等钙化生物矿物中不可见生物色素（biochromes）的原位检测、化学鉴定和规模化纯化。该技术通过温和提取（SDS-PAGE）、 Tris-tricine凝胶优化分离和紫外激发多光谱采集，首次在凝胶上直接识别出卟啉类色素（如uroporphyrin），并揭示其与生物大分子的相互作用，为古生物色素演化、生物矿化机制及化石有机分子保存研究提供了突破性技术平台。

　　

1 引言

钙碳酸盐生物矿物（如珊瑚外骨骼、软体动物贝壳、海胆棘刺）是由有机大分子（统称为骨骼基质）调控矿物沉积形成的有机-矿物组装体。除骨骼基质外，大量生物矿物还含有生物色素——一类在可见光范围有吸收的小分子有机化合物。这类物质结构多样，从具共轭双键的线性链（如类胡萝卜素）到含金属离子配位的复杂环状结构（如卟啉）均有涵盖。目前对贝壳生物色素的研究多采用强酸溶矿法提取，虽可快速获得大量色素，但会不可逆降解骨骼大分子并破坏色素-大分子复合物，难以用于研究古代或化石生物矿物中有机物的保存机制。

凝胶电泳（SDS-PAGE）是可视化生物矿物中大分子组分的常用技术，但对生物色素的检测存在三大局限：（1）对分子量约1 kDa及以下的游离色素分辨力不足；（2）小分子色素在凝胶染色过程中极易扩散损失；（3）与基质大分子结合的色素在自然光下不可见，且不被常规凝胶染料（考马斯亮蓝、硝酸银）染色。本研究开发的新方法通过耦合电泳分离与光致发光光谱成像，突破了上述技术瓶颈，实现了对不可见色素的原位鉴定及其与大分子相互作用的研究。

2 材料与方法

研究选取同属Trochoidea超科的现生腹足类Phorcus lineatus与始新世（约4500万年前）化石种Tectus crenularis的贝壳为材料。贝壳经次氯酸钠溶液彻底去污后粉碎成200 μm以下粉末，采用冷稀乙酸缓慢脱矿提取有机组分。可溶性基质（ASM）依次通过10 kDa和1 kDa截留超滤膜分级，并与酸不溶性基质（AIM）分别冻干保存。

分析型电泳采用15%聚丙烯酰胺Tris-tricine凝胶体系（Bio-Rad Mini Protean III），以提高低分子量组分的分离度。电泳后、染色前，立即使用定制多光谱成像系统采集凝胶的光致发光信号：该系统配备365–700 nm LED光源阵列和8通道干涉滤光片轮，结合高灵敏度CMOS相机（350–1100 nm）获取紫外激发下的荧光图像。此外，通过改装荧光光谱仪（HORIBA Fluorolog 3-22）直接在凝胶上采集色素的激发/发射光谱。

对于现生P. lineatus的足量样品，进一步采用制备型电泳（Bio-Rad model 491 Prep Cell）进行色素规模化纯化。色素组分经分级收集后，通过便携式光谱仪进行管中光谱鉴定。

3 结果

3.1 三步优化流程

本研究建立的三步法包括：（1）温和脱矿提取以保全色素-大分子复合物；（2）分析型电泳与PL光谱成像联用；（3）针对丰度样品开展制备型电泳纯化。步骤1–2适用于珍贵样品（如化石），而步骤1–3可应用于现生贝壳的大量提取物。

3.2 凝胶中生物色素的可视化

高浓度Tris-tricine凝胶结合自然光与PL成像，成功揭示了现生与化石贝壳提取物中的色素分布。在自然光下，P. lineatus提取物可见深褐色弥散条带（图2e），而化石样品仅显示微弱橙色信号。紫外激发后，凝胶底部迁移前沿前方出现强烈红色发光的离散条带（现生样品）或连续弱发光带（化石样品），表明PL成像对痕量色素的检测灵敏度显著优于自然光观察。

3.3 色素原位化学鉴定

通过凝胶上直接采集光谱，现生与化石样品中红色发光条带均显示卟啉特征光谱：激发谱中Soret带位于408 nm（现生）或400 nm（化石），并伴有5个Q带（500–650 nm）；发射谱呈现623/653 nm（现生）或617/648 nm（化石）双峰。与数据库比对表明，该光谱特征与尿卟啉I/III吻合，而非原卟啉IX。两种卟啉的迁移行为与光谱峰值差异提示其化学结构可能存在种间或成岩作用导致的修饰。

3.4 色素-大分子相互作用分析

电泳图中色素信号呈现两种模式：高分子量区域的弥散 smear 提示色素与大分子（蛋白质/多糖）通过共价键稳定结合；而凝胶底部的离散条带则代表游离态色素。该发现为解析色素在生物矿化中的存在形式提供了直接证据。

3.5 卟啉的规模化纯化

通过制备型电泳，成功从P. lineatus的ASM >10 kDa组分中分离出尿卟啉，其主要洗脱于第4–7管（图3b）。PL光谱显示洗脱组分纯度较高，且未被基质大分子污染，为后续结构解析与功能研究奠定了材料基础。

4 讨论

4.1 贝壳卟啉研究的比较

本研究结果与早期Comfort等人及近期Williams团队对Trochidae科腹足类贝壳中尿卟啉的报道一致。值得注意的是，Caenogastropoda子类物种中鉴定出的多为原卟啉IX，提示卟啉合成路径可能在腹足类不同演化支系间存在显著差异，这一发现为探讨软体动物色素生物合成的宏观演化提供了新视角。

4.2 技术流程的创新性

本方法的创新性体现在三方面：（1）首次将电泳技术用于天然样品中游离生物色素的分级；（2）通过多光谱成像优化荧光检测波段；（3）建立“电泳-PL成像-光谱采集”的有序分析流程。相较于传统技术（如HPLC、质谱），该方法在保留色素原位状态、解析复合物组成方面具有独特优势。

4.3 技术优势与应用潜力

该联用技术可实现色素与基质大分子的同步可视化，支持色素-蛋白质复合物的直接取样与后续蛋白质组学分析。其高灵敏度尤其适用于化石等痕量样品，为分子古生物学、考古学及保护科学提供了强大工具。此外，方法兼容常规凝胶染色，且主要试剂环境友好，易于在普通实验室推广。

4.4 局限性

全流程耗时较长（提取至纯化需1–2周），且仅适用于水溶性或酸溶性色素。对于脂溶性色素需另行开发提取方案。

4.5 未来展望

本技术框架可扩展至其他生物矿化体系（如蛋壳、珊瑚骨骼、微生物岩）及非矿化生物复合材料的研究。通过耦合拉曼光谱等成像技术，将进一步增强色素化学表征能力。在应用层面，该方法有望推动化石色素作为古环境代理指标的使用，并揭示生物色素在免疫响应、矿化调控等生理过程中的新功能。