基于表观遗传熵的乳腺癌时间景观图谱：揭示肿瘤生长年龄与临床预后的新维度

《Communications Biology》：Mapping the temporal landscape of breast cancer using epigenetic entropy

　　本研究针对乳腺癌诊断时肿瘤生长年龄未知的临床难题，开发了一种基于中性波动CpG位点(fCpG)的表观遗传时钟。通过分析全基因组甲基化阵列数据，研究人员构建了能够量化肿瘤有丝分裂年龄的表观遗传熵指数cβ，发现年轻肿瘤表现出更高的增殖活性和基因组不稳定性，而年老肿瘤则具有更强的免疫浸润特征。该时钟为乳腺癌风险分层和个体化筛查提供了新的生物标志物。

　　

当我们面对一位新诊断的乳腺癌患者时，一个关键但往往无法回答的问题是：这个肿瘤已经在体内生长了多久？肿瘤的年龄——从第一个肿瘤细胞开始增殖到被临床检测到的时间间隔——蕴含着重要的病因学和预后信息。快速生长的侵袭性肿瘤可能需要更积极的治疗，而生长缓慢的惰性肿瘤则可能适合更保守的管理策略。然而，由于缺乏可靠的生物标志物，个体化评估肿瘤年龄一直是个难以实现的临床目标。

传统的表观遗传时钟主要测量与组织年龄相关的甲基化累积，这类"单向"时钟适用于评估正常组织老化，但在肿瘤有丝分裂年龄估计方面存在局限。肿瘤有丝分裂年龄指的是从第一个肿瘤细胞开始计算所经历的细胞分裂代数，这一参数更能反映肿瘤的内在侵袭特性。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，研究人员开发了一种创新的"双向"表观遗传时钟，通过测量中性波动CpG位点(fCpG)的表观遗传熵来估计乳腺癌的年龄。与常规时钟不同，这种时钟不依赖于甲基化的单向累积，而是利用在甲基化和非甲基化状态之间快速波动的CpG位点，这些位点在细胞分裂过程中随机积累复制错误，从而像分子钟表一样记录肿瘤的进化历程。

研究团队整合了多个乳腺癌队列的DNA甲基化和基因表达数据，包括癌症基因组图谱(TCGA)的634例浸润性乳腺癌、79例正常乳腺组织样本，以及来自瑞典、德国和美国的多中心验证队列。他们通过两步筛选法识别出500个波动性最强且甲基化/去甲基化速率平衡的fCpG位点，构建了乳腺癌特异性的表观遗传时钟集合。

关键技术方法包括：利用450K甲基化芯片数据筛选fCpG位点；建立数学模型模拟fCpG动力学；通过基因集富集分析(GSEA)和CIBERSORTx免疫细胞分解分析肿瘤微环境特征；使用多焦点肿瘤和配对原发-转移样本验证时钟的内部一致性；基于振荡器模型定量估计肿瘤有丝分裂年龄和日历年龄。

选择无偏fCpG位点

研究人员首先从TCGA和正常乳腺组织队列中识别出平均甲基化值β介于0.4-0.6之间的CpG位点，确保这些位点没有明显的甲基化或去甲基化偏向。进一步在单细胞水平验证这些位点在乳腺管腔和基底上皮细胞中的平衡性，最终筛选出500个波动性最强的fCpG位点构成时钟集合。验证分析显示，时钟集合中的位点在肿瘤间的变异性显著高于非时钟位点，证实了其波动特性。

表观遗传时钟指数

研究团队引入表观遗传时钟指数c_β = 1-s_β作为肿瘤有丝分裂年龄的替代指标，其中s_β是时钟集合中fCpG位点β值的标准差。随着肿瘤有丝分裂年龄的增加，最初未甲基化、半甲基化和完全甲基化的fCpG位点的甲基化分布会逐渐收敛于β=0.5的稳态值，导致s_β降低而c_β升高。分析显示，浸润性小叶癌(ILC)的c_β值显著高于浸润性导管癌(IDC)，与ILC更容易在 mammography 检查中被漏诊的临床观察一致。

年轻肿瘤具有更侵袭的表型

研究发现，有丝分裂年龄较轻的肿瘤表现出更强的侵袭性特征：Luminal B型和基底样肿瘤比Luminal A型肿瘤更年轻；年轻肿瘤具有更高的基因组不稳定性(FGA)、更高的组织学分级和Ki-67阳性率。有趣的是，较小肿瘤反而具有较老的有丝分裂年龄，这可能是因为生长缓慢的肿瘤在可检测尺寸范围内停留时间更长。

识别肿瘤有丝分裂年龄的调节因子

肿瘤达到可检测大小所需的时间取决于其有效生长速率，即细胞增殖与死亡之间的平衡。基因表达分析显示，年轻肿瘤高表达增殖相关基因(如MCM2)，而年老肿瘤则表现出免疫标志物(CD3、CD4、CD8)的上调。通路富集分析进一步证实，年轻肿瘤富集于细胞周期相关通路，而年老肿瘤则富集于免疫应答通路。CIBERSORTx分解显示，年老肿瘤中T细胞比例显著增加，提示免疫监视在控制肿瘤生长中起关键作用。

配对肿瘤样本分析验证表观遗传时钟

在多焦点乳腺癌和配对原发-转移样本中，时钟表现出良好的内部效度：同一患者不同病灶的fCpG甲基化谱高度相关；转移灶的c_β值显著低于匹配的原发灶，符合转移发生在原发肿瘤进化后期的理论。转移播种时间越晚，原发与转移样本间的甲基化差异越大，这与基于振荡器模型的模拟结果一致。

量化肿瘤有丝分裂年龄

研究人员通过分解fCpG位点的β值分布为三个峰群(对应初始未甲基化、半甲基化和完全甲基化的位点)，结合振荡器模型定量估计了每个肿瘤的有丝分裂年龄(细胞分裂代数)和日历年龄(实际生长时间)。结果显示，基底样肿瘤的中位日历年龄仅为1.1年，而Luminal A型肿瘤达6.5年，这与侵袭性亚型更常见于间期癌的临床观察相符。

调整肿瘤纯度

考虑到肿瘤纯度可能对甲基化测量造成混杂，研究团队开发了纯度调整方法，发现即使在校正纯度后，年轻肿瘤与侵袭性特征的相关性依然稳健，虽然免疫相关信号的强度有所减弱。

这项研究开发的表观遗传时钟创新性地利用中性波动CpG位点的熵变来量化肿瘤的有丝分裂年龄，为理解乳腺癌的时间进化景观提供了新视角。研究表明，肿瘤达到检测阈值时的年龄反映了其有效生长速率，这是肿瘤内在增殖潜能与微环境外部压力之间进化生态学竞争的结果。该时钟不仅具有预后价值，还能为个体化筛查策略提供依据——生长缓慢的Luminal A型肿瘤有较长的sojourn time(停留时间)，适合常规筛查；而生长快速的基底样肿瘤sojourn time短，需要更频繁的监测。由于该时钟基于标准甲基化芯片技术，且不依赖于肿瘤的初始甲基化状态，具有良好的临床转化潜力，有望成为乳腺癌精准医疗中的重要工具。