肉类加工环境微生物动态变化的多阶段卫生干预效应研究

《Journal of Food Protection》：Effects of sanitation practices on microbial dynamics in meat processing environment

　　本研究针对商业牛肉加工厂卫生流程中微生物交叉污染问题，通过系统分析传送带、排水口和空气样本在四个卫生阶段（生产后、高压温水冲洗后、发泡脱脂后、消毒剂应用后）的微生物群落动态，发现高压冲洗会暂时增加细菌载量，而消毒剂对已清洁表面效果有限。测序结果显示不动杆菌（Acinetobacter）为优势菌属，源追踪模型揭示排水口和空气是传送带微生物的重要来源。该研究为优化食品加工卫生标准提供了关键数据支撑。

　　

在北美，尤其是美国和加拿大的肉类加工厂，执行常规的卫生程序是确保加工环境（包括设备表面）卫生状况的强制性要求。这些标准化的卫生流程旨在清除肉屑、脂肪、油污和油脂沉积物，并减少食品接触表面的微生物负荷。然而，尽管实施了这些标准化的卫生协议，加工过程中肉类产品的微生物污染仍然是一个挑战，这影响了微生物安全性并缩短了肉类产品的预期保质期。近年来，有研究利用高通量测序和生物信息学工具识别了猪肉胴体和分割肉在不同加工地点（如设备、员工和工厂基础设施）之间的潜在微生物传播途径。此外，研究表明，假单胞菌（Pseudomonas）和嗜冷杆菌（Psychrobacter）等微生物能够耐受清洁和消毒，这很可能与其形成生物膜和对抗菌剂的抗性有关。

在牛肉加工过程中，诸如剥皮等操作产生的气溶胶细菌已被认为是交叉污染的一个来源。例如，产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）经常在剥皮站附近的空气中被检测到。在工厂清洁过程的去除污物阶段，会使用高压温水冲洗。尽管这有助于清除食物残渣，从而减少表面的可见污染，但必须认识到高压水冲洗会产生气溶胶，即微颗粒。这些微颗粒一旦形成气溶胶，可以传播相当长的距离，并根据液滴大小在不同时间沉积在下行表面。有报道称，在食品加工设施中，与单独生产相比，使用高压喷雾同时进行生产和卫生处理期间空气中的细菌数量更高，这表明高压水冲洗具有转移细菌的潜力。然而，迄今为止，关于商业设施中清洁过程中产生的生物气溶胶在多大程度上导致食品接触表面的交叉污染，可用信息仍然有限。

为了填补这些空白，研究人员在一家商业牛肉加工厂进行了为期三个月的全面调查，检查整个卫生过程中不同阶段的微生物群落。他们收集了卫生过程中多个时间点的空气样本、传送带表面拭子和地漏拭子，并通过传统的基于培养的检测和16S rRNA基因扩增子测序进行分析。这项研究发表在《Journal of Food Protection》上，旨在揭示卫生流程各阶段对微生物负荷和组成的个体影响，以及微生物在加工环境中的传播动态。

本研究采用的关键技术方法包括：1) 在大型商业牛肉加工厂的特定传送带线、地漏和附近空气设定点进行系统采样，覆盖生产后、高压温水冲洗后、发泡脱脂清洁后以及消毒剂应用后四个关键卫生阶段；2) 使用基于培养的方法对总需氧菌、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、大肠菌群和大肠杆菌（Escherichia coli）进行定量分析；3) 对样本进行DNA提取，并利用针对16S rRNA基因V4区域的Illumina MiSeq平台进行扩增子测序；4) 使用QIIME2和DADA2等生物信息学工具处理测序数据，进行微生物群落多样性（Alpha和Beta多样性）分析和差异丰度分析（如MaAsLin2）；5) 应用贝叶斯源追踪工具SourceTracker2评估空气、传送带和地漏之间微生物的潜在传播途径。样本队列来源于同一加工厂内三个不同月份的三次独立采样行程。

Change in the numbers of indicator bacteria during sanitation

通过量化分析发现，在卫生过程的Stage 1（高压温水冲洗后），传送带表面的总需氧菌、肠杆菌科和大肠菌群数量均显著增加（P < 0.05），表明此步骤可能导致微生物从环境（如地漏或通过气溶胶）传播到传送带表面。而在Stage 2（发泡脱脂和冲洗后），这些指标菌的数量显著减少（P < 0.05），降低了超过2个对数单位，凸显了清洁剂步骤的有效性。然而，在Stage 3（施用消毒剂后），无论是传送带还是地漏样本，需氧菌数量均未受到显著影响（P > 0.05）。大肠杆菌在清洁前的传送带样本和卫生后的样本中均未检出，仅在卫生过程中的Stage 1阶段被零星检测到。对于地漏样本，即使检测到大肠杆菌，其数量也未受清洁或卫生步骤的显著影响。空气样本中的肠杆菌科计数低于检测限。

Bacterial communities of air, belt-surface and drain during sanitation as determined by 16S rRNA gene amplicon sequencing

基于16S rRNA基因测序的微生物群落分析显示，空气、传送带和地漏的细菌群落存在差异。Alpha多样性指数表明，空气和地漏样本的ASV（扩增子序列变体）丰富度和均匀度高于传送带样本。Beta多样性分析进一步确认了三者之间微生物群落的显著差异（P < 0.01）。不动杆菌（Acinetobacter）是所有三种样本类型中的优势菌属，其在空气、传送带和地漏中的总体相对丰度分别为51.18%， 46.06% 和 55.83%。其他常见菌属包括水生杆菌（Enhydrobacter）、甲基杆菌（Methylobacterium）、金黄杆菌（Chryseobacterium）、克雷伯菌（Klebsiella）和假单胞菌（Pseudomonas）。微生物组成随采样日期（行程）而变化。对原始空气样本和富集培养样本的微生物群落分析比较表明，尽管存在一些差异，但16S测序结果能较好地代表空气中可存活微生物的多样性。

Dynamics of the processing plant microbial communities during sanitation

对不同卫生阶段微生物群落动态的深入分析揭示了显著的变化。在空气样本中，Stage 0时热杆菌（Thermus）和克雷伯菌（Klebsiella）的相对丰度较高，但在Stage 1后显著下降并持续处于低水平；而鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）的相对丰度则随着卫生过程的进行而增加。不动杆菌在空气中的相对丰度在不同阶段保持稳定。在传送带样本中，假单胞菌的相对丰度在Stage 1后显著降低，而水生杆菌和甲基杆菌的相对丰度则在整个卫生过程中逐渐增加，并在Stage 3达到峰值。不动杆菌在传送带上的相对丰度在Stage 1后有所增加，但在Stage 2（清洁剂应用后）和Stage 3（消毒后）呈现下降趋势。地漏样本中的微生物群落也发生了显著变化，不动杆菌的相对丰度从Stage 0到Stage 3持续下降。源追踪（SourceTracker2）模型预测，在卫生过程开始时，传送带上的微生物有57.4%可能来源于地漏；但随着卫生过程的推进，空气的贡献逐渐增大，在Stage 3成为主要来源（43.4%）。模型还提示了微生物在空气、传送带表面和地漏之间存在复杂的相互传播。

本研究通过综合运用传统微生物培养和现代分子生态学方法，深入揭示了商业牛肉加工厂卫生过程中微生物群落的动态变化和传播路径。研究结果表明，标准的卫生流程，特别是高压水冲洗步骤，虽然能去除可见污物，但也可能通过生成生物气溶胶和再沉积过程，导致微生物在加工环境中的转移和暂时性增加。清洁剂步骤能有效降低微生物负荷，但后续使用的消毒剂（包括过氧乙酸和季铵盐类）在工厂实际应用条件下（如传送带持续运行、表面存在残留水分），对已经清洁的表面微生物群落影响有限。不动杆菌作为加工环境中的优势菌属，其持久存在值得关注。研究还通过源追踪模型量化了地漏和空气作为传送带表面微生物来源的相对贡献，为理解交叉污染路径提供了直接证据。

这项研究的意义在于它强调了需要重新评估当前肉类加工厂的卫生策略，特别是消毒剂应用的有效性以及考虑卫生操作本身可能带来的微生物传播风险。研究发现，最终的卫生效果不仅取决于化学药剂的杀菌效力，还深受微生物在环境介质间迁移的影响。那些在卫生后表面上仍占相当比例的细菌属（如不动杆菌、假单胞菌、水生杆菌、甲基杆菌和窄食单胞菌Stenotrophomonas）的生态角色和其对食品安全的潜在影响（例如，在腐败或病原体持久存在中的作用）需要进一步研究。该研究为优化卫生协议、针对关键污染源和传播途径进行干预，以及最终提高肉类产品的微生物安全性和保质期提供了重要的科学依据。