3-乙基亚烯-6-二甲基氨基异吲哚-1-酮通过胺基修饰制备，是一种用于开启式标记的溶致变色荧光团，具有优异的稳定性

《Tetrahedron》：3-Ethylidene-6-dimethylaminoisoindolin-1-one formed via amine modification, a solvatochromic fluorophore for turn-on labeling with enhanced stability

　　本研究设计了一种新型环境敏感荧光探针3-乙基烯基-6-二甲基氨基异吲哚啉-1-酮（3），通过甲基取代亚甲基结构（2）的C=N双键，显著提升酸性条件（pH6）下的稳定性（24小时后保留率提高至65%-85%），同时保持类似溶剂极性响应的荧光特性。密度泛函理论计算表明甲基取代使HOMO能级升高（-5.48→-5.42 eV），削弱质子化反应倾向，验证了稳定性提升机制。该探针为基于吗啉酮骨架的蛋白质特异性荧光修饰提供了新策略。

　　

刘一轩|阿部幸子-萨达松|太田千代子|裴阳|麻生麻里子

日本福冈市东区前田町3-1-1，九州大学药学研究生院，812-8582

摘要

在特定位置用环境敏感荧光团标记的蛋白质可以作为强大的探针和传感器。我们设计了一种6-二甲基氨基亚甲基异吲哚-1-酮的3-亚乙烯基衍生物，这种荧光团之前已被开发出来，它是通过目标蛋白质中的赖氨酸残基与带有蛋白质结合配体的o-酮苯甲醛衍生物反应生成的。然而，之前开发的荧光团在酸性条件下的不稳定性一直是个问题。在烯烃上引入一个额外的甲基后，该亚乙烯基荧光团在酸性条件（pH 6）下的稳定性得到了提高，同时保持了类似的荧光特性。在pH 7的缓冲液中，从o-酮苯甲醛衍生物形成亚乙烯基荧光团的效率与形成亚甲基荧光团的效率相似。本研究中开发的这种稳定的亚乙烯基荧光团的胺修饰方法，可能有助于我们利用o-酮苯甲醛衍生物对赖氨酸残基进行独特的荧光激活修饰。

引言

荧光标记是可视化生物分子位置和生物过程的重要工具。在感兴趣的位置用环境敏感荧光团标记的蛋白质可以作为强大的探针和传感器，通过荧光变化提供有关蛋白质-配体相互作用、蛋白质-膜相互作用以及蛋白质-蛋白质相互作用的有用信息。通过引入荧光氨基酸和可点击的手柄，并进一步反应引入荧光团，可以利用遗传编码扩展策略来生产位点特异性的荧光标记蛋白质。已经通过配体导向标记和化学酶促反应在特定位置对天然蛋白质进行了荧光标记，这些反应在生物相容的温和条件下进行，由此产生的荧光蛋白质已成功用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。我们曾报道使用携带o-酮苯甲醛衍生物的寡脱氧核苷酸（ODNs）对与DNA相互作用的蛋白质进行荧光激活标记，该衍生物能将伯胺转化为溶剂致色荧光团6-二甲基氨基-3-亚甲基异吲哚-1-酮（方案1）。这种反应可以用作模板导向标记，用于修饰目标蛋白质中ODN结合位点附近的赖氨酸残基。

3-亚甲基异吲哚-1-酮骨架是邻苯二甲酰亚胺的碳异构体，其荧光特性取决于苯环上的取代基。二甲基氨基衍生物在溶剂介电常数增加时，λ_emmax呈线性增加，荧光强度呈线性降低。这些性质与二甲基氨基邻苯二甲酰亚胺相似，后者表现出对溶剂极性敏感的分子内电荷转移发射特性，其氨基酸类似物已被引入肽中用于通过荧光监测肽-蛋白质相互作用。相比之下，二甲基氨基衍生物可能适合使用带有其他蛋白质结合配体的o-酮苯甲醛衍合物对天然蛋白质进行标记。然而，荧光团在磷酸盐缓冲液中逐渐降解，尤其是在酸性条件下。在25°C下，pH 6的溶液中24小时后大约有65%的荧光团残留，而在pH 8的缓冲液中则分别有45%的荧光团残留；而在37°C下，两种温度下的残留率均为约85%。这种不稳定性可能导致经过胰蛋白酶消化和随后的MALDI-TOF质谱测量后，无法检测到带有荧光团的修饰残基。我们推测荧光团中的烯酰胺部分在酸性条件下容易发生水合，形成非荧光产物（图1a）。在PCM/B3LYP/6-31+G(d,p)基组下进行的水中的密度泛函理论计算表明，在烯烃部分引入一个甲基后，HOMO（最高占据分子轨道）能级分别提高了：对于2（R = H）为-5.48 eV，对于亚乙烯基3（R = Me）为-5.42 eV（图S1）。相比之下，自然种群分析预测，在3中带有甲基的烯烃碳上的负电荷较小，表明3中的烯烃通过质子化的水合反应可能较少发生，因此3的性质值得进一步研究。2中的烯烃部分是引入额外功能的潜在位点，需要研究烯烃取代对产物稳定性和荧光特性的影响。因此，我们合成了亚乙烯基衍生物3，以获得在蛋白质修饰中具有更高稳定性的荧光团。

节选内容

亚乙烯基-6-二甲基氨基异吲哚-1-酮的合成及其性质

亚乙烯基化合物4是3的N-6-羟基己基衍生物，通过邻苯二甲酰亚胺5的酰胺化反应合成（方案2）。反应的主要产物E-异构体4E通过沉淀法分离出来。4E和其Z-异构体4Z的烯烃几何结构通过它们的NOESY光谱中的交叉峰得到证实。

亚乙烯基4E继承了亚甲基衍生物6的荧光特性。在2-PrOH溶液中，4E在吸收最大值292 nm和362 nm处被激发时，分别在462 nm处发出荧光（表1，图2）

通用方法

NMR光谱是在Bruker Avance III（1H为500 MHz，13C为125 MHz）或JEOL JNM-ECZL500R光谱仪上记录的。化学位移以ppm为单位，参考残余溶剂信号（CDCl₃；δH = 7.26 ppm和δC = 77.16 ppm，CD₃OD；δH = 3.31 ppm和δC = 49.00 ppm，(CD₃)₃CO；δH = 2.05 ppm和δC = 29.84 ppm）。UV-Vis光谱是在SHIMAZU UV-2450光谱仪上测量的。荧光光谱是在JASCO FP-6300上测量的。高分辨率光谱是在Bruker micrOTOF上记录的。

CRediT作者贡献声明

麻生麻里子：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。刘一轩：研究，数据管理。阿部幸子-萨达松：研究，数据管理。太田千代子：研究，数据管理。裴阳：研究，数据管理。

利益冲突

没有需要声明的利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了JSPS KAKENHI项目（项目编号22K05318）的支持。