全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露与多发性硬化症风险关联的孟德尔随机化研究及机制探索

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) exposure and multiple sclerosis: Evidence of association and mechanistic insights

　　本研究针对全氟烷基物质（PFASs）暴露与自身免疫病（ADs）关联性不确定的问题，通过孟德尔随机化（MR）和广义摘要数据孟德尔随机化（GSMR）分析，发现全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露与多发性硬化症（MS）风险显著正相关（OR=1.310）。进一步结合网络毒理学、机器学习筛选出CASP3、STAT3、ESR1、GSK3B四个关键靶基因，并通过分子对接、分子动力学模拟及免疫浸润分析揭示了PFOS可能通过PPAR信号通路和胞葬作用影响MS发病机制，为环境污染物致自身免疫病提供了新的机制见解和干预靶点。

　　

在当今工业化和化学产品广泛使用的时代，环境中持久性污染物的健康风险日益受到关注。其中，全氟烷基物质（PFASs）是一类具有卓越防水防油性能的合成化学品，被广泛应用于纺织品、食品包装和消防泡沫等领域。然而，它们的极端环境持久性和生物累积性导致了全球范围的污染，使得人类不可避免地长期暴露于这类物质中。越来越多的证据表明，PFASs暴露可能与免疫系统功能紊乱有关，进而潜在影响自身免疫病（ADs）的发生发展。自身免疫病是一类复杂的免疫系统疾病，其特征是机体免疫系统错误地攻击自身组织，导致慢性炎症和组织损伤，如多发性硬化症（MS）、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮等。尽管遗传易感性是主要因素，但环境触发因素的作用不容忽视。

然而，传统观察性流行病学研究在探讨PFASs与自身免疫病关联时，面临着一个核心挑战：难以确定因果关系。这是因为观察性研究容易受到混杂因素（如生活方式、社会经济状况等）和反向因果关系（即疾病状态可能影响体内污染物水平）的干扰。例如，之前有研究发现高暴露人群中的全氟辛酸（PFOA）与溃疡性结肠炎发病率相关，但这些发现的确切因果性质仍不明确。此外，传统的毒理学研究往往聚焦于单一的分子靶点或简化的剂量-反应关系，难以全面刻画PFASs这类物质可能引起的多层面、多效性的网络级扰动。因此，迫切需要采用能够提供更强因果推断证据并整合多维度数据的研究策略，来深入探究PFASs暴露与自身免疫病风险之间的潜在联系及其内在生物学机制。

为了解决上述问题，发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上的一项研究，由川北医学院基础医学研究所的刘星海、王欣和王莉团队完成，进行了一项整合性分析。研究人员旨在利用遗传学工具来评估PFASs暴露与多种自身免疫病之间的潜在因果关系，并进一步揭示其背后可能存在的分子机制。他们特别聚焦于两种最具代表性的PFASs：全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS），以及十种常见的自身免疫病，包括多发性硬化症（MS）、类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）等。

为了开展这项研究，研究人员主要应用了几项关键技术。首先，他们利用了两样本孟德尔随机化（MR）和广义摘要数据孟德尔随机化（GSMR）方法，基于大规模全基因组关联研究（GWAS）的公开摘要数据（暴露数据来自包含8299名欧洲裔个体的研究，结局数据来自FinnGen数据库），来评估PFASs暴露与自身免疫病风险的潜在因果关系。其次，对于发现显著关联的疾病，他们整合了网络毒理学方法，通过多个化合物-靶点预测数据库筛选PFOS的潜在作用靶点，并结合来自基因表达综合（GEO）数据库的MS患者基因表达数据，识别交集靶基因。接着，他们利用机器学习算法（共评估了113种算法组合）从蛋白互作网络模块中筛选出关键靶基因。最后，通过分子对接和分子动力学（MD）模拟验证PFOS与关键靶蛋白的结合稳定性，并利用CIBERSORT算法进行免疫细胞浸润分析，以探索关键基因与免疫微环境的关联。

3.1. MR分析

研究人员首先进行了MR分析，以探索PFOA和PFOS暴露与十种自身免疫病的潜在关联。他们选择了与PFASs暴露显著相关的单核苷酸多态性（SNP）作为工具变量，并采用了五种MR方法进行估计，其中逆方差加权（IVW）法是主要分析方法。结果显示，在针对十种自身免疫病的分析中，只有PFOS暴露与多发性硬化症（MS）的风险显示出统计学上显著的正向关联。IVW方法得出的优势比（OR）为1.310，意味着基因预测的PFOS暴露水平每增加一个单位，患MS的风险增加31.0%，其95%置信区间（CI）为1.041至1.648，P值为0.021。其他MR方法（如MR-Egger、加权中位数等）的结果趋势一致，支持了这一发现。为了确保结果的稳健性，研究团队进行了广泛的敏感性分析。他们评估了SNP之间的异质性（使用Cochran's Q检验），未发现显著异质性。同时，他们使用MR-Egger截距检验和MR多效性残差和与异常值（MR-PRESSO）检验来评估水平多效性（即SNP通过暴露以外的途径影响结局），结果均未检测到明显的多效性证据。此外，留一法分析表明，剔除任何一个SNP都不会对整体关联估计产生实质性影响。这些敏感性分析共同增强了PFOS与MS存在因果关联结论的可信度。

3.2. GSMR分析

为了进一步验证MR分析的结果，研究团队采用了GSMR这一方法。GSMR能够更好地处理SNP之间的连锁不平衡（LD），并通过异质性依赖工具（HEIDI）检验排除可能具有多效性的异常SNP，从而提供更稳健的关联估计。GSMR分析的结果与初步MR分析的结果相互印证。它同样揭示出PFOS暴露与MS风险之间存在显著的正向遗传关联，其OR值为1.287（95% CI: 1.019-1.624, P=0.034）。这一致的结果进一步强化了PFOS暴露可能是MS发病风险因素的证据。

3.3. 交集靶基因的识别与功能富集分析

在确定了PFOS与MS之间存在潜在因果关联后，研究进入机制探索阶段。首先，研究人员从GEO数据库获取了MS患者的基因表达数据集（GSE108000和GSE135511），经过批次效应校正和整合后，包含99例MS样本和45例对照样本。通过差异表达分析，他们识别出4868个MS相关的差异表达基因（DEGs）。同时，他们利用PharmMapper、SEA、STITCH和SuperPred等多个数据库预测了PFOS可能作用的分子靶点，共得到314个PFOS相关靶基因。将这两组基因进行交集分析，获得了107个既与PFOS潜在作用相关又在MS中差异表达的“交集靶基因”。对这些交集靶基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，发现它们显著富集于多种生物过程，如对生物碱的反应、脂质代谢过程的调控等。在分子功能上，则富集于核受体活性、配体激活的转录因子活性等。特别值得注意的是，KEGG通路分析提示，PPAR信号通路和胞葬作用（efferocytosis）是两条高度相关的通路。

3.4. PPI网络分析

为了理解这107个交集靶基因之间的相互作用关系，研究人员构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。该网络包含100个节点和584条边，显示出这些基因之间存在广泛的相互作用。利用Cytoscape软件的MCODE插件对网络进行模块分析，他们识别出一个包含18个基因的核心功能模块，这些基因可能作为协同的功能单元在PFOS影响MS的过程中发挥关键作用。

3.5. 关键靶基因的筛选

接下来，研究团队采用了一种强大的数据挖掘策略来从上述18个模块基因中筛选出最关键的目标。他们运用了12种机器学习算法（包括Lasso、随机森林RF、XGBoost等），组合成113种不同的模型，在训练集（整合后的MS数据集）上通过十倍交叉验证进行特征选择和模型构建。通过比较所有模型在外部验证集（GSE21942）上的表现，发现Stepglm[both]+RF组合模型性能最优，其平均曲线下面积（AUC）达到0.942。该模型最终筛选出四个关键靶基因：CASP3（半胱天冬酶-3）、STAT3（信号转导与转录激活因子3）、ESR1（雌激素受体1）和GSK3B（糖原合成酶激酶-3β）。决策曲线分析（DCA）和临床影响曲线（CIC）分析均表明该模型具有良好的临床实用性。进一步分析显示，这四个关键基因在MS患者中的表达水平显著高于健康对照。单独每个基因的诊断效能（AUC）也表现良好，例如CASP3的AUC高达0.895。

3.6. 免疫浸润

为了探讨PFOS通过这四个关键基因如何影响MS的免疫微环境，研究人员使用CIBERSORT算法估算了样本中22种免疫细胞的比例。结果发现，与健康对照相比，MS患者的免疫细胞浸润模式发生了显著改变，其中M2巨噬细胞浸润增加，而滤泡辅助性T细胞和静息树突状细胞减少。相关性分析进一步揭示了关键基因与特定免疫细胞亚群之间的复杂调控网络。例如，STAT3的表达与M1巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞呈正相关，而与浆细胞呈负相关。GSK3B则与M0巨噬细胞、静息肥大细胞和自然杀伤（NK）细胞正相关，但与滤泡辅助性T细胞和M2巨噬细胞负相关。这些结果表明，这些关键靶基因可能通过调节免疫细胞浸润参与MS的病理过程。

3.7. PFOS与四个关键靶蛋白结合稳定性的评估

最后，为了在分子水平上验证PFOS与筛选出的关键靶蛋白之间是否存在直接相互作用，研究团队进行了分子对接和分子动力学（MD）模拟。分子对接结果显示，PFOS与CASP3、STAT3、ESR1和GSK3B四种蛋白均能稳定结合，结合能分别为-6.6, -6.8, -9.1和-7.6 kcal/mol。随后进行的100纳秒分子动力学模拟从动态角度评估了复合物的稳定性。关键指标包括均方根偏差（RMSD，衡量蛋白骨架随时间的变化）、回转半径（Rg，衡量蛋白结构的紧凑度）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键数量。模拟结果表明，所有四个PFOS-蛋白复合物在整个模拟过程中都保持了良好的稳定性，其中GSK3B-PFOS复合物的RMSD最低，表明其结构最稳定；CASP3-PFOS复合物的Rg和SASA值最低，表明其构象最紧凑。氢键分析显示这些复合物在模拟过程中能形成并维持多个氢键。自由能景观分析进一步证实复合物倾向于处于明确的低能态。这些计算生物学结果强有力地支持了PFOS能够直接、稳定地与CASP3、STAT3、ESR1和GSK3B这四个关键靶蛋白结合，为其直接干预这些蛋白的功能提供了结构基础。

研究的讨论部分对上述发现进行了深入的综合分析。本研究的核心发现是通过MR和GSMR两种遗传学方法，一致地揭示了PFOS暴露与MS风险增加之间存在正相关，而并未发现PFOA与所研究的十种自身免疫病，以及PFOS与其他九种自身免疫病之间存在显著关联。这一发现为澄清此前流行病学研究中的不一致结果提供了基于遗传证据的因果支持。讨论中指出，MS的病因涉及遗传和环境因素的复杂交互，而关于PFOS在MS中的作用此前存在争议，甚至有研究报道MS患者体内PFOS水平较低或与疾病进展延缓相关。本研究的结果从疾病易感性角度提供了新的视角。

在机制层面，研究筛选出的四个关键靶基因——CASP3、STAT3、ESR1和GSK3B，均在MS的已知病理生理过程中扮演重要角色。CASP3是细胞凋亡的关键执行者，据报道在MS及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中参与小胶质细胞的焦亡。STAT3是调节免疫和炎症反应的核心转录因子，其在中性粒细胞等髓系细胞中的激活被证明可促进EAE中的致病性T细胞分化和神经炎症。ESR1介导的雌激素信号通路在神经保护和调节神经炎症中起重要作用，雌激素E2对EAE的保护作用正是通过ESR1实现的。GSK3B则是一种关键的激酶，其活性升高与慢性进展型MS的神经炎症和脱髓鞘有关。PFOS被证明能与这些蛋白稳定结合，提示它可能通过直接干扰这些蛋白的功能而参与MS发病。

通路富集分析突出了PPAR信号通路和胞葬作用的重要性。PFOS是PPARα和PPARγ的已知激动剂。讨论中提出了一个合理的假设：PFOS可能通过异常激活PPAR信号，破坏免疫和神经细胞内的精细平衡。例如，PFOS对PPARγ的过度激活可能使小胶质细胞极化为促炎表型，同时损害胞葬作用（即清除凋亡细胞的过程）。胞葬功能失调会导致凋亡细胞发生继发性坏死，释放自身抗原，从而维持慢性炎症状态，这正是MS等自身免疫病的特征。同时，PPARα信号紊乱可能损害少突胶质细胞中的脂肪酸β-氧化，影响其存活和髓鞘再生能力。因此，PFOS可能通过协同扰乱PPAR信号通路和胞葬作用，共同推动MS的核心病理环节——神经炎症、脱髓鞘和神经元损伤。

此外，免疫浸润分析的结果将关键靶基因与MS的免疫微环境改变联系起来，揭示了它们可能通过调节巨噬细胞极化、肥大细胞功能、T细胞应答等具体免疫过程发挥作用。这为理解PFOS的免疫毒性提供了更细致的细胞层面证据。

研究者也客观地指出了本研究的若干局限性。首先，所有遗传数据和表达数据均来自欧洲裔人群，结论的外推性需在其他人群中进行验证。其次，研究仅聚焦于两种PFASs和十种自身免疫病，可能遗漏其他重要的关联。再次，尽管机器学习模型表现出色，但其在训练集上近乎完美的精度提示可能存在一定程度的过拟合，需要在更大的独立队列中进一步优化和验证。最后，所有机制分析均基于计算和生物信息学方法，最终的生物学相关性需要后续的体外和体内实验研究来证实。

综上所述，这项研究通过整合孟德尔随机化、网络毒理学、机器学习和计算生物学等多种前沿方法，提供了PFOS暴露增加多发性硬化症风险的遗传学证据，并深入揭示了其潜在的作用靶点（CASP3、STAT3、ESR1、GSK3B）和分子机制（涉及PPAR信号通路和胞葬作用）。这些发现不仅增进了我们对环境污染物如何触发或加剧自身免疫病的科学理解，也为未来开发针对性的预防策略和干预措施提供了重要的理论依据和候选靶标。该研究展示了多组学整合分析在环境健康研究中的强大能力，强调了从遗传关联到分子机制的系统性探索对于全面评估环境污染物健康风险的重要性。