综述：不同氧化还原条件下水生环境中罗兹菌门（Rozellomycota）的生态学

《Fungal Biology》：Ecology of Rozellomycota in aquatic environments with differing redox conditions

　　本文系统综述了罗兹菌门（Rozellomycota）在水生生态系统（特别是沉积物和废水处理系统等还原性环境）中的分布与生态功能。作者通过分析EUKARYOME数据库等公共数据，指出该类群（属于全菌界Holomycota）虽基因组信息逐渐增多，但其生态学认知仍非常匮乏，尤其在适应不同氧化还原条件（如厌氧环境）的机制方面。文章探讨了其可能的寄生生活方式（宿主包括壶菌Chytridiomycota和卵菌Oomycetes）以及与微孢子虫Microsporidia的进化关系（如新提出的Opisthophagea类群），并强调了未来研究需聚焦于氧化还原梯度生境以阐明其生态角色与进化适应。

　　

Abstract

近期研究发现，罗兹菌门（Rozellomycota）这一研究尚浅的全菌界（Holomycotan）谱系在水生生态系统中广泛存在，使其成为理解水生生态和真菌进化的关键类群。尽管基因组数据逐渐增多，但关于罗兹菌门的生态学知识仍非常稀缺。通过汇总公共数据库中的出现记录，可以明确它们在水生环境中的丰度，有趣的是，在富碳沉积物中占主导地位。类似地，富含碳和营养的人工废水环境作为高度还原环境的范例，尽管是原核生物主导的生态系统，却栖息着多样化的罗兹菌门谱系。由于来自厌氧环境的罗兹菌门并非单系群，这就引出了罗兹菌门如何适应不同氧化还原条件以及其寄生生活方式是否可能导致厌氧化的问题。

Introduction

罗兹菌门是一类研究尚浅的单细胞全菌界谱系，近期研究证实其在水生生态系统中繁盛，在许多水样中均有发现。随着对其在水生栖息地中已知普遍性的了解加深，理解罗兹菌门的系统发育多样性和生态学变得日益重要。在水生生态系统中，罗兹菌门被认为通过充当浮游生物、游动孢子真菌的寄生虫或在贫营养和中贫营养环境中的分解者，在营养循环的控制和调节中扮演重要角色。然而，最近发现罗兹菌门也存在于活性污泥过程和氧化沟中。此外，在厌氧废水环境和滴滤式工程系统中，罗兹菌门的丰度与其他真核生物相当。这些发现挑战了罗兹菌门是仅限于淡水环境的贫营养谱系的观念，反而将其置于可能的氧化还原电位和营养梯度的两个极端。本文重新评估了罗兹菌门的栖息地，考虑了它们存在于对比鲜明的氧化还原条件环境中的意义。

Background and Taxonomy of Rozellomycota

罗兹菌门的分类学分类依赖于形态特征和分子系统发育方法的结合。过去十年的系统发育分析揭示了罗兹菌门作为接近真菌的谱系具有巨大的多样性。实际上，多基因系统基因组学将罗兹菌门归入后鞭毛生物亚群全菌界（或称核裂菌纲Nucletmycea），与核形虫阿米巴、微孢子虫（Microsporidia）、灭噬菌门（Aphelida）和真菌（Fungi）在一起。

罗兹菌门也被称为罗兹菌目（Rozellida），以最著名的罗兹菌属（Rozella）命名。隐真菌门（Cryptomycota）作为门级名称被提出，认为能更准确地代表整个门。同义地，其他研究提出了罗兹菌门（Rozellomycota）或罗兹孢子虫门（Rozellosporidia）等名称。该门类研究不足的主要因素可归因于其形成微小、不显眼的细胞，以及作为寄生虫的兼性不可培养性，导致缺乏培养物。因此，目前大多数知识基于环境DNA序列，通常以SSU核糖体RNA基因作为主要遗传标记，指出了高度的生物多样性。这种知识的缺乏和未知谱系的存在催生了“暗物质真菌”或“暗真菌类群”的术语，包括对于理解地球上最古老真菌谱系进化至关重要的知之甚少的真菌谱系。

2018年，Letcher和Powell回顾了罗兹菌属的分类学，列出了27个已知物种。该属显示出四个编码几丁质合成所需蛋白质的 distinct 基因。尽管对罗兹菌门存在巨大的知识空白，但罗兹菌Allomycis（Rozella allomycis）作为培养代表，是一种寄生于巨大异水霉（Allomyces macrogynus）的菌寄生菌，已知作为裸原生质体生长的细胞内寄生虫，具有单个大的线粒体。罗兹菌（Rozella）在其生命周期中大多缺乏真菌的几丁质细胞壁，尽管有例外。在其生命周期中，罗兹菌属（Rozella spp.）经历四种可能的形态：单鞭毛游动孢子（zoospores）、无壁菌体（thalli）、内生原生质体（protoplasts），以及如果需要，形成休眠孢子（resting spores）。这个循环的步骤基于对罗兹菌Allomycis的研究，与寄生性壶菌门（Chytridiomycota）在附着宿主、 encystment、 appressorium 形成以穿透宿主细胞、复制以及最终游动孢子形成方面相似。与壶菌类似，在生长不利条件下可以形成几丁质壁的休眠孢子。

最初的隐真菌门（Cryptomycota）以及生物类群微孢子虫（Microsporidia）和灭噬菌门（Aphelida）在发现后不久被归类为超门后孢子虫门（Opisthosporidia），这是基于共享的结构特征和它们在SSU rDNA基因系统发育中的单系性（有时支持度较低）。在生态上，两者都是寄生虫，灭噬菌门（Aphelida）感染藻类，微孢子虫（Microsporidia）是后生动物（Metazoans）和一些原生生物的细胞内寄生虫，具有高度简化的基因组（有时达到原核基因组的大小）。在真菌学中，也有人提议将所有谱系归入罗兹菌门（Rozellomycota），这是目前被接受的分类学。在本文中，我们将罗兹菌门（Rozellomycota）指代为除长分支的核心微孢子虫（Microsporidia）、梅奇尼科夫菌科（Metchnikovellidae）和壶菌纲（Chytridiopsida）之外的所有谱系。特别是，核心微孢子虫谱系的位置长期存在争议，现在越来越多的证据指向其与罗兹菌门作为微孢子虫纲（Microsporidea）的稳定姐妹分支位置。目前，多基因系统基因组学研究提出后孢子虫门（Opisthosporidia）是并系群，将微孢子虫（Microsporidia）、罗兹菌门（Rozellomycota）和灭噬菌门（Aphelida）分类为两个新的单系群：后噬菌纲（Opisthophagea）（罗兹菌门+微孢子虫）和植噬菌纲（Phytophagea）（真菌+灭噬菌门）。

Ecology of Rozellomycota

Van Hannen等人（1999年）首次在藻类分解实验中鉴定出罗兹菌门的DNA序列。在给定的生态背景下，大多数发现的DNA序列被归类为推定的分解者。Gleason等人（2012年）提出，罗兹菌属（Rozella spp.）通过减缓分解过程来加强碳汇，以及对土壤、淡水和海洋环境中微生物群落的结构和复杂性产生显著影响，从而显著影响水生和陆地食物网。例如，罗兹菌门对浮游植物寄生性壶菌门（Chytridiomycota）的超寄生通过将生物量中的有机质动员回环境，为能量和营养流动提供了调节反馈。与壶菌门（Chytridiomycota）类似，通过调节其宿主种群，并作为纤毛虫、枝角类和一些后生动物等食草动物的潜在食物来源，多层寄生为水生食物网增加了复杂的调节维度，这通常被称为真菌环（mycoloop）。尽管罗兹菌门寄生代表在营养循环中的作用类似于其他微生物寄生虫，但我们对这些生物对淡水生态系统影响的理解仍然有限。这一知识空白最近一项关于饮用水砂滤池的研究进一步凸显，该研究意外地揭示了多样化的推定为浮游生物的罗兹菌门群落，强调了对该真菌谱系进行全面生态学研究的迫切性。

尽管最初在淡水中发现，但罗兹菌门存在于各种栖息地，包括海洋和土壤生态系统。然而，大多数研究集中在淡水或海洋谱系的系统发育、生态学和生命周期上。Quandt等人（2023年）最近的一项调查揭示了罗兹菌门在从土壤、淡水、海洋样本到废水和分解实验的栖息地中的巨大多样性。该研究确定了12个不同的非栖息地特异性分支。大多数成员散布在不同的生态系统中，除了一个单一的海洋分支；然而，即使这个分支也来自相当多样化的栖息地，从冷泉到沉积物表层水样。

为了进行更广泛的栖息地分析，我们将搜索范围扩展到公共数据库EUKARYOME的序列。EUKARYOME数据库汇编了所有潜在栖息地的核糖体长读长数据，其中大部分来自全球土壤样本，并列出了24,957条属于65个分支的罗兹菌门序列（不包括微孢子虫）。通过根据整个数据库（所有真核生物）的采样工作量进行归一化来调整偏向土壤样本的偏差后，我们计算了每个样本来源的相应序列比例。与Quandt等人（2023年）主要关注自然、水生和区域栖息地的研究相比，更全面的EUKARYOME数据库允许从全球样本中识别基于栖息地的聚类。除了土壤占主导的分支外，还有水、沉积物占主导的分支，以及少数由废水/污泥占主导的分支。很明显，罗兹菌门在水生栖息地中占主导地位，特别是沉积物、水、藻类样本和废水。总体而言，我们使用最近验证的核糖体SSU和LSU序列的更全面数据库进行的分析表明，水生生态系统确实是罗兹菌门的主要栖息地，尽管也存在仅存在于土壤中的谱系。虽然应记住基于DNA的环境调查的局限性，但这些结果补充了Glotova和Nassonova（2022年）的图景，其中淡水和废水被汇编为罗兹菌门的主要栖息地。此外，罗兹菌门序列在其推定的宿主壶菌门（Chytridiomycota）和卵菌（Oomycetes）的主要栖息地中的高频率支持了这两个谱系是罗兹菌门主要宿主的假设。最近开发的用于罗兹菌门分子定量的定量PCR将有助于进一步细化环境丰度，并将其与环境和非生物因素联系起来。

Rozellomycota along aquatic gradients

我们的发现，即沉积物成为罗兹菌门的主要栖息地，是引人入胜的，因为沉积物代表了一个碳丰富但可用电子受体受限的环境，这导致沉积物表面存在陡峭的氧化还原梯度。这与来自废水环境的报告一致，废水环境表现出类似的条件，最近在这些环境中发现了罗兹菌门。Gad等人（2024年）关注废水处理过程不同步骤中的微真核生物多样性，发现罗兹菌门是所有处理阶段中最丰富的微真核生物类群。虽然几项研究已经证实了罗兹菌门的优势地位和代谢活性，但其潜在的生态机制和具体的代谢活动尚未完全了解，仍在研究中。尽管如此，发现了与废水处理厂效率的相关性，甚至提出罗兹菌门作为监测系统性能的生物指示剂，这得到了Lawson等人（2015年）先前发现的的支持，该发现将罗兹菌门丰度与高磷去除联系起来。罗兹菌门在淡水沉积物中的高频率及其在废水系统中的普遍存在是其通过适应腐生生活方式或专门化于在这些环境中常见的宿主而实现富营养环境功能和进化适应的强有力指标。在Onodera等人（2021年）的研究中，一个实验室规模的下流式悬挂海绵（DHS）反应器系统在海绵内具有氧化还原梯度，也显示罗兹菌门是主要的真核生物。据报道，罗兹菌门占真核生物群落的35%至49%，与早期研究DHS系统的结果一致。从生态学角度来看，这些发现提出了一个问题：寄生虫能否在捕食者-猎物模型中达到优势地位，或者这是否只能通过消费者策略来解释。此外，Watari等人（2021年）的结果指向一个潜在的宿主生物，而不是卵菌（Oomycetes）或壶菌门（Chytridiomycota），这两者在工程废水系统中并不普遍。

Rozellomycota occurrence in anaerobic environments

考虑到已知的真核厌氧生物的稀缺性，废水处理厂和反应器系统的部分厌氧环境是罗兹菌门多样性的意外储存库。罗兹菌门是少数丰富的真核谱系之一（其次是肺泡藻类），在厌氧消化池样本中占总OTU的14%，并且也有报道存在于缺氧冷泉沉积物以及高硫化物缺氧地下水中。所有这些栖息地的共同点是它们的高度还原状态，这只允许非常有限的代谢过程和低能量获取。这些无氧环境中的主要代谢过程包括初级和次级发酵、硫酸盐还原、乙酸生成和产甲烷作用，这些通常由小细胞大小的原核微生物促进。最近一项关于短鞭毛虫（breviates，厌氧欧巴zoan阿米巴鞭毛虫）的研究表明，参与氮和硫循环途径的原核生物也可以与厌氧原生生物建立代谢相互作用，影响其生长和存活。此外，有证据表明，厌氧代谢的代谢基因簇通常是通过来自细菌的跨域水平基因转移获得的。

在真菌界内，发酵代谢的著名例子包括酵母目（Saccharomycetales）的酵母，以及降解纤维素的专性厌氧瘤胃壶菌样新Callimastigomycota门（Neocallimastigomycota）。这两种生物都独特地适应了缺氧环境，后者用氢化酶体取代了线粒体以产生能量。类似的代谢和结构适应在类真菌的卵菌中观察到，例如芽囊菌属（Blastocystis spp.）的专性厌氧肠道定植者，它们显示出简化的线粒体细胞器（MRO：线粒体相关细胞器）和过氧化物酶体，不完整的TCA循环和替代末端氧化酶。基于他们对芽囊菌（Blastocystis）的研究，作者得出结论，过氧化物酶体和线粒体同时简化的进化过程是由保护免受活性氧和脂质代谢驱动的。然而，这种细胞器丢失强烈限制了能量代谢，推动生物走向厌氧或寄生生活方式，这种转变也得到水平基因转移的支持。与这些发现一致，Timofeev等人（2020年）强调，在罗兹菌门及其姐妹谱系中可以发现类似的细胞器和代谢基因简化，最终导致专性细胞内寄生。此外，线粒体的丢失促进了向替代代谢策略的转变，例如替代氧化酶（AOX），或者如肠道栖息的微孢子虫梅奇尼科夫菌科（Metchnikovellids）中所见，采用脱氢酶重新氧化还原当量的发酵途径。总的来说，这些发现支持了罗兹菌门内各种谱系已经进化出厌氧呼吸或发酵途径的假设。

鉴于代谢简化要么导致寄生，要么导致厌氧化，很可能罗兹菌门的厌氧非寄生分支在早期的研究中被忽视了。Quandt等人（2023年）确定了主要在废水中出现的分支，指向微需氧（活性污泥）或厌氧环境（厌氧污泥消化池）。厌氧污泥消化池为产甲烷作用维持一个高度还原的环境，具有长的水力停留时间和相对较高的温度，以细菌发酵菌和古菌产甲烷菌为优势微生物。在这个独特的工程环境中，获得了多个属于I、II、III、V、VI、VII和VIII分支的罗兹菌门序列（即在12个描述的分支中有7个）。这些发现为罗兹菌门在还原环境中的普遍丰度提供了证据。来自类似还原的自然环境的观察结果进一步支持了这一结论，例如淡水沉积物（根据图2，罗兹菌门的主要栖息地之一），根据湖泊的营养状态，这些沉积物经常变为厌氧状态，然而，由于浮游生物和浮游动植物休眠期的沉降，其推定的宿主范围比厌氧消化池更多样。

与厌氧真菌（仅以新Callimastigomycota门的形式非常稀疏地进化，导致了一个全新的专性厌氧真菌分支，以及兼性厌氧发酵酵母）相比，厌氧性状存在于大多数已知的罗兹菌门谱系中。许多罗兹菌门似乎要么对氧气不敏感，要么可以轻松地在厌氧环境中进化或适应。这可能与细胞器简化和氧化磷酸化的普遍丢失有关，如Timofeev等人（2020年）所述；然而，需要来自厌氧环境的进一步实验证据来最终澄清罗兹菌门寄生与厌氧化的联系，以及这可能如何解释其巨大的系统发育多样性。为了澄清这些点，我们需要将罗兹菌门生态学和进化的研究转向这些研究甚少的缺氧和厌氧环境。

Conclusion

本文汇编了当前关于罗兹菌门的知识，分析了其序列的来源，并证实了其对水生栖息地的偏好。我们还记录了它们在还原环境中的存在，特别是在沉积物、废水系统和厌氧消化池中。罗兹菌门显示出广泛