海洋哺乳动物环境DNA检测新突破：海獭eENLU6检测方法的建立与海洋沉积物eDNA提取方法比较研究

《Environmental DNA》：Comparison of DNA Extraction Methods for Detecting the Sea Otter (Enhydra lutris ) in Marine Sediments

　　本文首次建立了针对海獭（Enhydra lutris）的环境DNA（eDNA）检测方法eENLU6，并系统比较了四种海洋沉积物eDNA提取方法。研究发现，PowerSoil方法在检测海獭沉积物eDNA方面表现最佳，而传统水样eDNA检测方法在海獭自然栖息地中的检测效率有限。该研究为利用沉积物eDNA追踪海洋哺乳动物分布提供了重要方法学基础。

　　

2.1 检测方法设计与验证

研究团队开发了一种针对海獭的特异性eDNA检测方法eENLU6，该方法基于定量PCR（qPCR）技术，采用unikseq生物信息学流程从海獭全线粒体基因组中筛选出独特的检测区域。该检测方法产生的目标扩增片段为333 bp，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.3拷贝/反应和1.3拷贝/反应，显示出极高的灵敏度。

验证实验表明，eENLU6检测方法能够有效区分海獭与其他可能混淆的物种，包括密切相关的物种和地理分布重叠的海洋哺乳动物。研究人员在温哥华水族馆和蒙特雷湾水族馆的海獭饲养池中进行了实地验证，结果显示即使在单个海獭存在的情况下，也能检测到高浓度的海獭DNA，拷贝数估计值分别达到753,136±26,316拷贝/升和249,899±13,847拷贝/升。

2.2 野外样品采集

研究团队于2023年夏季在加拿大不列颠哥伦比亚省海岸线收集了36个海水样品和82个沉积物样品。采样点根据海獭的出现情况分为三类：海獭长期缺失区域（Absent sites）、季节性出现区域（Inlet sites）和稳定分布区域（Established sites）。沉积物样品包括从海獭觅食坑和粪便附近采集的机会性样品。

值得注意的是，在采样期间，仅在Tahsish Inlet一个站点观察到了约15只海獭组成的群体，其他站点虽无直接观测到海獭，但存在大量海獭近期活动的证据，如密集的觅食坑和带有海獭捕食痕迹的蛤蜊壳。

2.3 海水样品eDNA提取与分析

海水样品通过0.45 μm混合硝酸纤维素滤膜过滤后，使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒进行DNA提取。分析结果显示，在12个海水采样点中，有3个样品的DNA质量不符合IntegritE-DNA测试标准，表明样品可能已降解。在剩余的8个海水样品中，仅在Louise Channel和Tahsish Inlet两个站点检测到海獭DNA，拷贝数估计值分别为90±45拷贝/升和169±87拷贝/升。

这一结果与自然环境中鲸豚类动物eDNA检测难度较大的研究报道一致，尽管海獭在稳定分布区域的种群密度可能高于其他海洋哺乳动物。

2.4 沉积物eDNA提取方法比较

研究团队系统比较了四种沉积物eDNA提取方法：Filter Soil方法、Norgen方法、PowerMax方法和PowerSoil方法。每种方法使用不同的样品湿重、提取试剂盒和洗脱体积，以确保起始DNA浓度和内参指标的可比性。

结果显示，Filter Soil方法提取的样品中未能检测到海獭DNA，即使是在添加了海獭组织DNA的阳性对照样品中也是如此。Norgen方法仅在添加组织DNA的样品中检测到海獭DNA。PowerSoil方法在检测海獭沉积物eDNA方面表现最佳，在Gay Passage和McKay Lagoon的沉积物样品中成功检测到海獭DNA。

DNA产量分析表明，PowerMax方法提取的DNA量显著高于其他方法（22-192 ng/g沉积物），但高DNA产量并不总是与目标物种检测效率正相关。IntegritE-DNA测试（叶绿体DNA检测）和eFISH1测试（鱼类DNA检测）结果显示，Filter Soil方法提取的样品中存在高水平PCR抑制剂，而其他三种提取方法则能获得适合质量的内参DNA检测。

2.5 沉积物eDNA清洁方案比较

研究还评估了两种DNA清洁方案对沉积物eDNA提取效果的影响：异丙醇浓缩结合Zymo清洁方案和磁珠浓缩清洁方案。结果表明，清洁步骤虽然可能去除PCR抑制剂，但也会导致DNA损失，降低目标DNA的检测灵敏度。

特别是对于PowerMax方法提取的样品，清洁处理后反而降低了海獭DNA的检测效率。这一发现强调了在选择eDNA分析方法时需要权衡抑制剂去除和DNA保留之间的关系。

3.1 验证的eDNA检测方法

eENLU6检测方法在实验室条件下表现出高灵敏度，但在自然环境中的应用效果受到多种因素影响。海水样品中海獭eDNA的检测率远低于预期，即使在已知海?活动频繁的区域也是如此。这可能与海洋环境中DNA的快速稀释和降解有关。

3.2 沉积物eDNA提取方法比较

沉积物eDNA分析结果显示，不同提取方法对海獭DNA的检测效率存在显著差异。PowerSoil方法在检测海獭沉积物eDNA方面表现最优，而Filter Soil方法由于未能有效去除PCR抑制剂，导致检测失败。

研究还发现，沉积物类型、DNA片段大小和提取方法的选择都会影响宏生物eDNA的检测效率。较短的DNA片段（如eFISH1检测的153 bp片段）比较长的片段（如eENLU6检测的333 bp片段）更容易在沉积物中保存和检测。

讨论与展望

本研究首次尝试使用沉积物eDNA检测海洋哺乳动物，为利用这种新兴技术研究海獭等海洋哺乳动物的历史和当前分布提供了重要方法学基础。研究结果表明，沉积物eDNA在海洋哺乳动物监测中具有潜力，但需要优化提取和检测方法以提高灵敏度。

未来研究可以探索更短的DNA靶标片段或杂交捕获技术，以提高降解DNA的检测效率。同时，需要考虑海洋环境因素如沉积物组成、水动力条件等对eDNA保存和分布的影响。

这项研究为开发更有效的海洋哺乳动物eDNA监测方法提供了重要见解，特别是在沉积物eDNA分析方面的方法学创新，为利用这种非侵入性技术研究濒危海洋物种的生态学提供了新的可能性。