基于转基因斑马鱼胚胎cyp3a65表达的EMERGE检测方法：评估肠道代谢内分泌干扰物的新替代策略

《Environment International》：A new alternative method using cyp3a65 expression in transgenic zebrafish embryos to assess metabolic endocrine-disrupting chemicals in the intestine

　　本研究针对代谢内分泌干扰化学物(MDCs)缺乏肠道特异性评估方法的问题，开发了基于tg(cyp3a65:GFP)转基因斑马鱼胚胎的EMERGE检测新方法。研究发现cyp3a65在肠道发育过程中呈现动态表达，可被zfPXR和zfAhR2激动剂以浓度和时间依赖性方式调控。通过筛选22种环境化学物，首次发现多种物质能显著调控肠道cyp3a65表达，为评估MDCs的肠道代谢干扰效应提供了新的体内模型。

　　

在当今环境污染日益严重的背景下，代谢内分泌干扰化学物(MDCs)对人类健康的威胁不容忽视。这类物质通过干扰关键代谢信号通路，与肥胖、2型糖尿病和脂肪肝等代谢性疾病的发病率和发病率上升密切相关。然而，目前缺乏能够有效评估MDCs在肠道这一重要代谢器官中作用机制的相关检测方法。肠道作为外源性物质进入机体的第一道屏障，其代谢功能紊乱可能对整个机体代谢稳态产生深远影响。

在这项发表于《Environment International》的研究中，法国国家工业与环境风险研究院(INERIS)的Chedi Erradhouani等研究人员开发了一种创新的替代方法——EMERGE检测(Effects of Metabolic Endocrine disRuptors in Gut of zebrafish Embryos)，利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因斑马鱼胚胎来评估MDCs在肠道中的代谢干扰活性。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用Tol2转座子系统建立tg(cyp3a65:GFP)转基因斑马鱼品系；通过活体荧光成像技术动态监测cyp3a65表达时空分布；使用RT-qPCR验证内源性基因表达；应用免疫组织化学确认蛋白定位；按照OECD测试指南设计标准化暴露实验。

研究结果方面，通过时空表达特征分析发现，cyp3a65-GFP和内源性cyp3a65在胚胎发育过程中呈现相似的动态表达模式，从72小时受精后(hpf)开始表达，并在120 hpf达到峰值。表达特异性定位在肠道前部，这一发现通过免疫组织化学得到证实。

在浓度效应关系研究中，研究人员发现zfPXR激动剂氯咪唑(CLO)和zfAhR2激动剂TCDD均能以浓度依赖性方式诱导cyp3a65表达，且GFP荧光强度与内源性mRNA表达水平高度一致。时间动力学实验表明，化学物暴露24小时后即可检测到显著的基因表达变化。

通过建立的EMERGE检测方法对22种化学物进行筛选，结果显示大多数物质能够显著调控肠道cyp3a65表达。二噁英类物质(TCDD、PeCDD)和氧化多环芳烃(5,12-NQ、BaAQ)表现出最强的诱导活性，最低观察效应浓度(LOEC)达到皮摩尔级别。双酚类物质中，BPA、BPB、BPC和BPF均能诱导cyp3a65表达，而BPS和TCBPA则无显著效应。农药和药品中，氯吡硫磷(CPF)、三氯生(TCS)、氯咪唑(CLO)和胺碘酮(AMD)显示诱导作用，而合成糖皮质激素(FLU、CLOBE)则显著抑制cyp3a65表达。

研究结论表明，EMERGE检测方法作为一种新的、易于使用的检测手段，能够在非哺乳动物模型中筛选化学物的代谢干扰活性。该研究首次提供了多种环境化学物直接靶向肠道并干扰这一关键代谢酶的证据，为理解MDCs的肠道特异性作用机制提供了重要见解。值得注意的是，研究结果与人类CYP3A4调控数据存在较高一致性，提示该方法可能为评估化学物对人类CYP3A4的影响提供有价值的信息。

讨论部分强调了EMERGE检测方法的优势和局限性。作为首个用于评估肠道代谢干扰效应的脊椎动物模型，该方法能够通过活体成像实现个体水平检测，并考虑全身暴露下的代谢过程。然而，该方法主要检测早期受体介导的转录反应，需要与其他检测方法结合来评估慢性代谢紊乱结局。与人类基于检测方法的比较显示，在12种有可用数据的物质中，8种在EMERGE和人类细胞检测中均显示活性，表明该方法具有良好的预测价值。

该研究的科学意义在于填补了当前代谢干扰物评估中肠道特异性检测方法的空白，为监管层面提供了新的评估工具。随着欧盟OBERON项目推动的综合测试策略发展，EMERGE检测方法有望成为评估内分泌干扰物相关代谢紊乱的重要组成部分，为保护人类健康和环境安全提供科学依据。