聚苯乙烯纳米塑料通过线粒体功能障碍和DNA损伤诱导太平洋牡蛎血细胞毒性机制研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Cytotoxicity of polystyrene nanoplastics involves mitochondrial dysfunction and DNA damage in hemocytes of the Pacific oyster

　　本研究针对纳米塑料对海洋生态系统的潜在威胁，通过体外细胞生物测定方法，探讨了90 nm聚苯乙烯纳米塑料（NanoPS）在太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）血细胞中的分布、代谢干扰和遗传毒性。研究发现，NanoPS可被血细胞内化并分布于囊泡、胞质和细胞核中，导致代谢活性抑制（LC50 = 91.6 mg/L）和活性氧物种（ROS）水平升高，并在低至1.2 mg/L浓度下即可引起DNA损伤。研究进一步通过半乳糖（GAL）和葡萄糖（GLU）补充实验证实，线粒体代谢增强会加剧NanoPS的细胞毒性和DNA损伤，而促进无氧代谢则可减轻这些效应。该研究揭示了线粒体是双壳类血细胞中纳米塑料的敏感靶点，强调了在评估纳米塑料毒性时考虑有氧代谢的重要性，为利用血细胞模型补充体内研究以阐明海洋生物中纳米塑料毒性机制提供了有力支持。

　　

海洋，这片覆盖地球表面超过70%的广阔水域，孕育着无数生命，也正承受着人类活动带来的巨大压力。其中，塑料污染已成为一个全球性的环境挑战。从巨大的塑料垃圾到肉眼难以察觉的微小颗粒，塑料制品在自然环境中逐渐分解，形成了所谓的微塑料（尺寸小于5毫米）和更小的纳米塑料（尺寸小于1000纳米或1微米）。这些微小的塑料颗粒，尤其是纳米塑料，由于其极小的尺寸，能够穿越生物屏障，与亚细胞结构相互作用，甚至在不同组织和世代间传递，对海洋生物构成了潜在的严重威胁。

在众多海洋生物中，双壳类滤食性生物，如牡蛎、贻贝和蛤蜊，扮演着“海洋哨兵”的角色。它们固定在海底或礁石上，通过过滤大量海水来获取食物，这使得它们不可避免地会摄入水中悬浮的颗粒物，包括塑料碎片。因此，双壳类生物成为研究纳米塑料对海洋生物影响的理想模型。其中，太平洋牡蛎（Crassostrea gigas，又称Magallana gigas）因其全球性的经济重要性和在海岸带生态研究中的广泛应用而备受关注。牡蛎的免疫系统依赖于其血细胞（hemocytes），这些循环的免疫细胞负责抵御病原体、清除异物，并参与伤口愈合、营养运输等多种生理过程。当纳米塑料进入牡蛎体内后，血细胞是最先与之接触并作出反应的细胞类型之一。然而，纳米塑料是如何被血细胞摄取？它们会在细胞内如何分布？又会引发怎样的毒性效应？其背后的分子机制是什么？这些问题对于准确评估纳米塑料的生态风险至关重要。

为了回答这些问题，由Rafael Trevisan领导的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项研究，题为“聚苯乙烯纳米塑料的细胞毒性涉及太平洋牡蛎血细胞的线粒体功能障碍和DNA损伤”。研究人员利用太平洋牡蛎的血细胞作为体外模型，开展了一项综合性的毒理学研究。

为了开展这项研究，研究人员主要应用了几项关键技术。他们首先合成了约90纳米的聚苯乙烯纳米塑料（NanoPS），并利用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对其形貌、尺寸和在不同介质（超纯水、过滤海水、血淋巴血清）中的分散稳定性进行了表征。研究的核心是建立太平洋牡蛎血细胞的体外培养体系，血细胞来源于在实验室条件下驯化的牡蛎。在此基础上，他们进行了一系列细胞毒性评估：使用刃天青（resazurin, RES）测定法评估细胞代谢活性（反映整体能量代谢），使用中性红（neutral red, NR）测定法评估溶酶体完整性。此外，还利用荧光探针DCFDA检测了细胞内活性氧物种（ROS）的水平，并通过彗星实验（comet assay）来定量分析DNA损伤。为了深入探究线粒体在纳米塑料毒性中的作用，研究人员设计了功能性实验，包括使用线粒体解偶联剂FCCP进行共暴露，以及通过在半乳糖（GAL，促进线粒体代谢）或葡萄糖（GLU，促进糖酵解）补充的培养基中培养细胞，来观察不同代谢状态下NanoPS毒性的变化。

3.1. NanoPS表征

研究人员成功合成了球形NanoPS，平均直径为90.4 ± 6.7纳米。在超纯水中，NanoPS带强负电荷，分散稳定。然而，在过滤海水（FSW）和用于细胞培养的血淋巴血清（HS）中，NanoPS的表面电荷降低，并发生明显的聚集，尤其是在FSW中形成巨大聚集体，在HS中形成中等大小的聚集体。这表明在接近生理条件的介质中，NanoPS倾向于聚集，这可能影响其生物可利用性。

3.2. NanoPS毒性评估

细胞活力测定显示，NanoPS对牡蛎血细胞具有浓度依赖性的毒性。基于代谢活性的RES测定更为敏感，其半数致死浓度（LC₅₀）为91.6 mg/L，而基于溶酶体完整性的NR测定的LC₅₀为252.3 mg/L。在亚致死浓度（0.6-5 mg/L）下即可观察到毒性效应。通过对照实验排除了NanoPS合成过程中使用的表面活性剂SDS、铝氧化物（Al₂O₃）核心纳米颗粒以及可溶性副产物是主要毒性来源的可能性，证实毒性主要来自NanoPS颗粒本身。

3.3. TEM分析

透射电镜观察直观地展示了NanoPS在血细胞内的命运。研究人员发现了两种血细胞形态：透明血细胞和颗粒血细胞。在暴露于NanoPS后，可以清晰地看到尺寸在90-100纳米之间的原始NanoPS颗粒分布在细胞的胞质和细胞核内。随着暴露浓度的增加，细胞内出现了含有致密物质的囊泡（可能为溶酶体或吞噬溶酶体）以及更大的聚集体（尺寸可达350纳米至1.4微米）。此外，在5和10 mg/L浓度下，细胞还出现了空泡化和囊泡增大等亚细胞结构改变，提示可能存在线粒体肿胀或自噬泡形成。

3.4. ROS水平和DNA损伤

氧化应激和遗传毒性是纳米塑料毒性的重要方面。研究发现，在5 mg/L的NanoPS暴露下，血细胞内的ROS水平显著升高了约50%。更重要的是，彗星实验结果显示，即使在低至1.2 mg/L的浓度下，NanoPS就能引起显著的DNA损伤，表现为彗星出现频率和DNA损伤指数分别增加了5-6倍和7-10倍。这表明NanoPS具有强烈的基因毒性潜力。

3.5. 细胞活力和线粒体毒性评估

为了探究线粒体是否在NanoPS毒性中发挥作用，研究人员进行了更深入的实验。首先，他们使用线粒体解偶联剂FCCP与NanoPS共暴露。有趣的是，FCCP并未加剧NanoPS引起的细胞死亡，反而在某种程度上表现出拮抗效应，即共暴露时细胞存活率高于单独暴露于NanoPS。研究人员推测这可能与FCCP和NanoPS之间的疏水性相互作用降低了FCCP的生物可利用性有关。然而，关键的功能性实验——代谢底物补充实验——提供了明确的证据。当细胞在半乳糖（GAL）补充的培养基中培养（迫使细胞更多地依赖线粒体有氧呼吸）时，NanoPS的毒性显著增强，细胞死亡在更低浓度下就开始出现。相反，当细胞在葡萄糖（GLU）补充的培养基中培养（促进糖酵解，减少对线粒体的依赖）时，NanoPS的毒性被减轻。这一结果强有力地表明，线粒体功能是NanoPS毒性的一个关键靶点，增强线粒体代谢会加剧毒性，而转向无氧代谢则具有保护作用。

3.6. 线粒体应激下的DNA损伤评估

研究人员进一步考察了在不同代谢状态下NanoPS引起的DNA损伤。结果与细胞活力实验相呼应：在促进线粒体代谢的GAL条件下，NanoPS诱导的DNA损伤更为严重；而在促进糖酵解的GLU条件下，DNA损伤则有所减轻。此外，尽管FCCP单独暴露对细胞活力影响不大，但与NanoPS共暴露时，却进一步加剧了DNA损伤。这些发现将线粒体功能障碍、氧化应激（ROS产生）和遗传毒性（DNA损伤）联系起来，提示线粒体可能是NanoPS引发DNA损伤的重要源头之一。

综合以上研究结果，可以得出以下主要结论：首先，90纳米的聚苯乙烯纳米塑料能够被太平洋牡蛎血细胞内化，并分布于胞质、囊泡和细胞核等多个亚细胞区域。其次，NanoPS对血细胞具有显著的毒性，表现为抑制代谢活性和破坏溶酶体完整性，并能在较低浓度下诱导氧化应激和DNA损伤。第三，也是本研究最核心的发现，即线粒体是NanoPS毒性的敏感靶标。通过巧妙的代谢调控实验（GAL/GLU补充），研究证实增强线粒体有氧代谢会显著放大NanoPS的细胞毒性和基因毒性，而促进无氧代谢则可起到保护作用。这提示线粒体功能障碍以及由此可能产生的过量ROS是NanoPS毒性机制中的重要环节。

这项研究的意义重大。在理论层面，它深入揭示了纳米塑料对海洋无脊椎动物免疫细胞的毒性作用机制，特别是明确了线粒体代谢状态在其中的关键调节作用，将线粒体功能障碍、氧化应激和DNA损伤这几个关键的毒性通路联系了起来。在方法学上，该研究成功地将常用于药物筛选的GLU/GAL代谢表型分析策略应用于海洋生态毒理学研究，为评估污染物的线粒体毒性提供了新的思路。在实践层面，研究结果表明，基于血细胞的体外细胞生物测定法能够有效地模拟纳米塑料的体内毒性效应，所获得的半数效应浓度（LC₅₀）和最低观测效应浓度（LOEC）与已报道的枝角类水生模式生物大型溞（Daphnia magna）的体内毒性数据具有可比性。这支持了将血细胞模型作为体内研究的补充工具，用于快速、高效地筛选和表征纳米塑料的毒性，从而推动预测生态毒理学的发展。最后，该研究结果也警示我们，纳米塑料可能通过损害关键免疫细胞的能量代谢和遗传完整性，进而削弱双壳类生物的免疫功能和健康状况，这对评估塑料污染对海洋生态系统健康和生物多样性的潜在长期影响具有重要的生态学意义。